PI3K/AKT信号通路在CTGF促人增生性瘢痕成纤维细胞转分化中的作用

[摘要]目的：探讨磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路是否介导结缔组织生长因子促人增生性瘢痕成纤维细胞转分化。方法：体外培养人增生性瘢痕成纤维细胞，实验分3组：①空白对照组；②结缔组织生长因子（10ng/ml）刺激组；③磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002（10μmol/L）预处理后结缔组织生长因子刺激组。应用免疫印迹技术检测48h后a-平滑肌肌动蛋白的表达，应用流式细胞术检测a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率。 结果：和空白对照组相比，结缔组织生长因子刺激组细胞a-平滑肌肌动蛋白表达和阳性细胞百分率升高；经磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002预处理后，再以结缔组织生长因子刺激，细胞a-平滑肌肌动蛋白表达和阳性细胞百分率升高水平下降，经统计学分析，差别具有显著性（P＜0.05）。 结论：结缔组织生长因子能够促进人增生性瘢痕成纤维细胞转分化，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路介导该效应，磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002 可抑制此效应。

[关键词]结缔组织生长因子；增生性瘢痕；成纤维细胞；磷脂酰肌醇3激酶；蛋白激酶B；转分化；a-平滑肌肌动蛋白

[中图分类号]R619+.9[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）03-

Effect of connective tissue growth factor on the transdifferentation of human hypertrophic scar fibroblasts mediated by phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B( PI3K/PKB) signal pathway

LIU Jian-yi,LI Shi-rong

（Department of Plastic and Cosmetic Surgery, Southwest Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China）

Abstract： ObjectiveTo explore if the effect of connective tissue growth factor on the transdifferentation of human hypertrophic scar fibroblasts is mediated by phosphatidylinositol 3-kinase/ protein kinase B(PI3K/PKB) signal pathway. MethodsHuman hypertrophic scar fibroblasts were cultured in vitro. The cells were divided into three groups: ①control group，②connective tissue growth factor（10 ng/ml）stimulated group，③PI3K inhibitor LY294002（10μmol/ L）pretreated and connective tissue growth factorstimulated group. The expression of a-smooth muscle actin was examined by western blot in human hypertrophic scar fibroblasts after 48 hours. The positive ratio of a-smooth muscle actin was examined by flow cytometry.ResultsCompared with the control group, the expression and the positive ratio of a-smooth muscle actin in the connective tissue growth factor stimulated group increased. The raise level of a-smooth muscle decreased after the pretreatment of PI3K inhibitor LY294002. The results were markedly different by statistic analysis（P

Key words: connective tissue growth factor; hypertrophic scar; fibroblast; phosphatidylinositol 3-kinase; protein kinase B; transdifferentation; a-smooth muscle actin

增生性瘢痕（hypertrophic Scar，HS）是人类皮肤真皮损伤后以成纤维细胞过度增殖和细胞外基质如胶原等过度沉积为特征的皮肤纤维化疾病，其中成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞后促纤维化功能明显增强。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）是一种具有强烈促纤维化作用的生长因子，具有促进成纤维细胞转分化的作用[1]。磷脂肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路（PI3K /PKB）参与CTGF促HS纤维化（另文发表），但是否介导促转分化效应，尚未见报道。本研究拟应用CTGF刺激人增生性瘢痕成纤维细胞（hypertrophic Scar fibroblast，HSF），检测细胞a-平滑肌肌动蛋白的表达，并应用PI3K抑制剂LY294002 进行阻断，以初步明确PI3K /PKB信号通路在其中的作用。

1材料和方法

1.1 主要试剂：人重组CTGF购自美国peprotech公司。小鼠抗人a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体和FITC标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司产品。PI3K特异性抑制剂LY294002、辣根过氧化物酶连接的“二抗”、生物素化的蛋白相对分子质量标准及其抗体以及化学发光试剂均购自美国Cell Signaling Technology公司。预染的蛋白相对分子质量标准购自美国Promega 公司。DMEM培养基和新生小牛血清购自美国Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：实验所用HS组织取自我科因HS自愿行手术治疗的患者，均为创面愈合3个月以上瘢痕仍持续增生者，术前均取得患者同意，所取HS特点为外观发红、充血、质硬、高出皮面1cm以上，瘢痕增生局限于皮损区，局部伴瘙痒或疼痛等不适，共6例，其中男性4例，女性2例，年龄21～40岁，平均29.2岁。用酶消化法分离成纤维细胞，于37 ℃，CO2体积百分数5%的孵箱中培养，传代，实验用第5～7代细胞，用0.25%胰酶消化后，将细胞以8×105/瓶接种于75cm2培养瓶中，先用10% FBS－DMEM培养基培养12h，待细胞达到60%～70%融合后，用无血清培养基培养24h，使细胞达到同步，弃去培养基。实验分3组：①空白对照组；②结缔组织生长因子（10ng/ml）刺激组；③磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002（10μmol/L）预处理后结缔组织生长因子刺激组（先用10μmol/L LY294002 作用细胞60min，再与10ng/ml CTGF共同作用细胞30min）。

1.2.2 western blot法检测a-平滑肌肌动蛋白表达：采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 和免疫印迹杂交法。①药物作用：以10ng/ml CTGF作用HSF 48h；②细胞总蛋白的提取：弃去药物，预冷的磷酸盐缓冲液(PBS) 冲洗细胞，立即加入1×SDS 上样缓冲液（含62.5 mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸，2% SDS，10%甘油，50mmol/L 二硫苏糖醇，0.01%溴酚蓝），迅速刮下细胞，冰上裂解，冰上细胞超声15～20s，离心，取上清液于-70℃保存；③ SDS-PAGE和免疫印迹杂交：各取20μl 细胞裂解提取物，95℃变性5min，上样，进行电泳、转膜、洗膜后封闭，加入小鼠抗人a-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(1∶500)，4 ℃过夜，洗膜，加入二抗室温下作用1h，洗膜后加化学发光液，X线片曝光，对蛋白条带进行吸光度(A) 值测定。内参照采用GAPDH。蛋白含量以a-平滑肌肌动蛋白和内参蛋白的平均光密度(OD)×面积(mm2)的比值来表示。

1.2.3 流式细胞术检测a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率：制备细胞悬液，收集各组细胞(细胞培养于75cm2培养瓶中)；PBS漂洗细胞两次后，离心，得到细胞沉淀；4％多聚甲醛固定30min，离心，弃上清；用0.1％皂素(内含2%BSA)通透10min，以利于抗体进入胞内，离心，弃上清；加入鼠抗人平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(1:100)300μl，室温孵育1h；PBS洗涤两次后，加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育30 min；PBS洗涤两次后，重悬于300μl PBS溶液中，行FCM检测。

1.3. 统计学方法：实验重复3次，结果以x±s表示，应用SPSS10.0 软件进行数据统计。组间比较应用方差分析，P

2结果

2.1 a-平滑肌肌动蛋白表达情况：空白对照组有较少量的a-平滑肌肌动蛋白表达，当外源重组结缔组织生长因子刺激后，a-平滑肌肌动蛋白表达，而当应用磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002（10μmol/L）预处理后再刺激，a-平滑肌肌动蛋白表达升高较少，统计学分析，差别具有显著性（P＜0.05），结果见图1、表1。

2.2 a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率：应用流式细胞术检测a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率。和空白对照组相比，10ng/ml 结缔组织生长因子刺激组细胞a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率升高，统计学分析，差别具有显著性（P＜0.05）；经磷脂酰肌醇3激酶抑制剂LY294002（10μmol/L）预处理后，再以结缔组织生长因子刺激，a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率升高较少，和单纯刺激组相比，统计学分析，差别具有显著性（P＜0.05）。空白对照组和LY294002预处理后结缔组织生长因子刺激组相比较，无统计学差异（P＞0.05）结果见表2。

3讨论

HS是整形外科领域重点研究内容之一，其发生、发展主要是由成纤维细胞、细胞外基质和生长因子三者共同的作用导致，而抑制成纤维细胞的增殖和分化是抗纤维化的中心策略，生长因子在其中起极其重要的调控作用。在创面愈合瘢痕形成过程中，曾处于静止状态的成纤维细胞增殖并分化，其中70%左右的成纤维细胞分化为收缩表型，被称为肌成纤维细胞。它是介于成纤维细胞和平滑肌细胞之间的终末分化细胞，能够分泌大量的胶原和纤维连接蛋白，使细胞外基质沉积，a-平滑肌肌动蛋白是其标志性蛋白[2]。

CTGF是一种新发现的在纤维化病程中发挥重要促进作用的生长因子[3]，我们前期研究表明它具有促进成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞的作用[1]，但传递此效应的的具体细胞内信号通路还不清楚。PI3K/PKB是近年来发现的一个新的生长因子信号转导途径。PI3K是一种重要的细胞内蛋白激酶，当细胞受生长因子等刺激因子刺激后，细胞内PI3K活化，使其转化为3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3），并与其下游分子Akt 结合，活化的PI3K/Akt 可能通过TSC1/2 复合物进一步激活其中下游分子Mtor、eIF- 4E 结合蛋白1（4E- BP1）和核糖体蛋白P70S6K，启动蛋白质的翻译，因此磷酸化的PI3K被认为是蛋白质合成的主要信号调节通路，参与细胞增生、分化、移行等的调节[4-5]。在人肾系膜细胞中，PKB信号通路在CTGF诱导、细胞外基质沉积，细胞迁移和细胞骨架重排中起作用[6]。亦有研究表明PI3K/PKB通路参与转化生长因子-β1诱导人肾小管上皮细胞间质转分化过程[7]。

我们前期研究结果表明PI3K/PKB信号通路参与CTGF促HS纤维化（另文发表），其是否介导CTGF促成纤维细胞转分化？我们应用了PI3K特异性抑制剂LY294002预处理HSF，再以CTGF刺激，结果表明阻断后细胞a-平滑肌肌动蛋白表达较单纯刺激组下降，同时流式细胞术分析a-平滑肌肌动蛋白阳性细胞百分率亦下降，这说明LY294002阻断了PI3K/PKB信号通路，导致了a-平滑肌肌动蛋白整体水平下降，外源性CTGF不能通过PI3K/PKB信号通路产生促成纤维细胞转分化的效应，亦即PI3K/PKB信号通路介导了CTGF促成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的效应。但该信号通路效应对应的细胞核内靶信号分子仍有待于进一步研究。

[参考文献]

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[2]Shin D, Minn KW.The effect of myofibroblast on contracture of hypertrophic scar[J].Plast Reconstr Surg， 2004，113(2):633-640.

[3]刘剑毅，李世荣，纪淑兴.病理性瘢痕中结缔组织生长因子基因的表达[J]. 中国修复重建外科杂志, 2003, 17 (6):436-438.

[4]Xu G, Zhang W, Betram P, et al. Pharmacogenomic profiling of the PI3K/PTEN- AKT- mTOR pathway in common human tumors[J]. Int J Oncol,2004,24(4):893-900.

[5]Gao N, Zhang Z, Jiang BH, et al. Role of PI3K/AKT/mTOR signaling in the cell cycle progression of human prostate cancer[J]. Biochem Biophys Res Commun,2003,310(4):1124-1132.

[6]Crean JK, Finlay D,MurphyM, et al. The role of p42 /44 MAPK and p rotein kinase B in connective tissue growth factor induced extracellularmatrix p rotein p roduction, cell igration, and actin cytoskeletal rearrangement in human mesangial cells[J]. J Biol Chem, 2002, 277 (46): 44187-44194.

[7]张 勇，张 景.PI3/K的激活在TGF-β1 诱导肾小管上皮细胞间质转分化过程中的作用[J].医学杂志，2006，31（6）：553-555.

[收稿日期]2007-12-25 [修回日期]2008-03-07

注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”