PICK1在心肌梗死大鼠血清、心肌组织中的表达及意义

摘要：目的 研究急性心肌梗死大鼠血清及心肌组织中蛋白激酶Cα相互作用蛋白（PICK1）的表达及意义。方法 将43只清洁级Wistar大鼠随机分为3组：正常对照组8只，心肌梗死模型组20只，假手术组15只，心肌梗死模型组采用左冠状动脉前降支结扎法构建模型，假手术组仅在左冠状动脉主干下打一松节，正常对照组不做任何干预。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）及免疫印迹法（Western-blot）分别检测1 d，3 d，7 d各组大鼠血清和心肌组织中PICK1的表达水平。结果 与正常对照组及假手术组相比，心肌梗死模型组大鼠建模后1 d血清PICK1水平略有增高，但差异无统计学意义（P>0.05）；自3 d开始，模型组大鼠血清PICK1水平明显高于假手术组及正常对照组（P0.05）。结论 PICK1在心肌梗死大鼠血清及心肌组织中表达增高，可能在心肌缺血再灌注损伤中发挥一定的作用。

关键词：心肌梗死；蛋白激酶Cα相互作用蛋白；免疫印迹；酶联免疫吸附试验

中图分类号：R542.2 R256.2 文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2014.04.043

文章编号：1672-1349（2014）04-0466-02

冠状动脉阻塞相互作用蛋白引起的心肌缺血是缺血性心脏病中重要的致死原因，严重危害人类的健康，深入研究缺血性心脏病的分子机制，探索新的发病机制和治疗标靶，对缺血性心脏病的临床治疗具有重要的理论和现实意义。蛋白激酶C相互作用蛋白（PICK1）广泛表达于人和动物的各种组织，以大脑和中表达最高，肺中最低[1]。PICK1可与多种蛋白相互作用从而发挥多项生物学功能，现有的研究表明，PICK1与疼痛、脑卒中、精神分裂症及肿瘤等疾病相关[2-5]，其关键性作用使其成为上述疾病治疗的潜在靶点，而PICK1在心肌梗死方面的研究鲜见报道，本研究旨在观察PICK1在心肌梗死动物血清及心肌组织中的表达情况，探讨其在心肌梗死发生中的可能作用，为心肌梗死的研究提供新的思路和实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究材料 清洁级雄性Wistar大鼠由山西医科大学实验动物中心提供，体质量200 g～230 g。饲养条件：温度23 ℃，湿度95%，12 h明暗交替，大鼠专用饲料喂养。实验过程严格遵守伦理学准则。

1.2 心肌梗死动物模型制备 将43只Wistar大鼠随机分为3组：急性心肌梗死模型组20只，假手术组15只，正常对照组8只。心肌梗死模型组参照文献[6]的方法进行构建，采用1%戊巴比妥钠（剂量40 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，取仰位固定于手术台上，常规备皮消毒后，自胸骨左缘3～4肋间作一2 cm切口，钝性分离皮下组织及肌肉，打开心包，暴露心脏，以肺动脉圆锥和左心耳连线中点与心尖的连线为标志寻找左冠状动脉前降支，0号线结扎，结扎部位以下心肌颜色变暗，搏动减弱，心电显示ST段弓背抬高表明造模成功，将心脏还入胸腔，逐层缝合；假手术组仅于左冠状动脉前降支穿线，不做结扎，其余手术过程同模型组。

1.3 ELISA检测大鼠外周血PICK1的表达水平 分别于手术后1 d、3 d、7 d采集各组大鼠尾静脉血1 mL，室温自然凝固10 min，离心（10 min，3 000 r/min）取上清液，-70 ℃冰箱保存。ELISA检测步骤按照试剂说明书进行。

1.4 免疫印迹检测心肌组织PICK1的表达水平 分别于手术后1 d、3 d、7 d分批采用颈椎脱臼猝死大鼠，常规皮肤消毒，打开胸腔。称取心肌组织各0.1 g，眼科剪剪碎，加入组织裂解液，低温离心去上清（4 ℃，12 000 r/min，8 min），紫外分光光度计上测OD值，绘制标准曲线，计算蛋白含量。制备SDS-聚丙烯酰胺分离胶（8%）和浓缩胶（5%），分子量Marker及蛋白样本各上样20 μL，电泳槽中加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液，60 V预电泳40 min，100 V电泳50 min。湿转膜法将蛋白转至硝酸纤维素膜（NC）上，转膜条件：电压110 V，电流350 mA，时间30 min。蛋白干粉（上海生工）室温封闭1 h，按照说明书参考浓度稀释一抗（PICK1 1∶1 000； GAPDH 1∶500），将NC膜置于其中，4 ℃冰箱过夜反应，TBST（含吐温20）缓冲液洗膜3次后置于二抗（1∶3 000）中室温轻摇反应30 min，TBST洗膜3次，ECL发光液显色，凝胶成像仪曝光显色。Bandscan图像分析软件对显影条带进行灰度分析，以目的蛋白与内参的比值作为蛋白的相对表达水平，实验重复3次。

1.5 统计学处理 采用SPSS16.0软件进行统计学处理。数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P

2 结 果

2.1 各组大鼠血清PICK1的表达水平 20只心肌梗死模型组大鼠最终18只模型构建成功（2只大鼠实验过程中死亡，成功率90%），假手术组无大鼠死亡。与正常对照组及假手术组相比，心肌梗死模型组大鼠建模后1 d血清PICK1水平略有增高，但差异无统计学意义（P>0.05）；自3 d开始，心肌梗死模型组大鼠血清PICK1的水平明显高于假手术组及正常对照组（P

3 讨 论

PICK1是Staudinger等分离到的一个蛋白质，在人类、大鼠、小鼠等哺乳动物中PICK1氨基酸序列同源性在90%以上，单体分子量均在50 kDa左右[7]。该蛋白具有较为特殊的PDZ结构域和BAR结构域，除了和PKCα相互作用外，还能与细胞内不同受体有相互作用，诸如谷氨酸AMPA受体的GluR2和GluR3亚基、代谢型谷氨酸受体mGluR7a、多巴胺转运蛋白（DAT）、酸性敏感性通道受体（ASIC）等[8，9]。 据报道，PICK1不仅参与记忆，外周神经感觉，神经介质传递与调节，细胞的生长和黏合过程等生理学过程，而且在中枢神经系统疾病、恶性肿瘤等疾病中发挥一定的作用，由于PICK1与绝大多数配体蛋白的相互作用是通过其PDZ结构域与配体C末端区域的结合介导的，使PICK1的PDZ结构域成为一个潜在的药物靶点。

最近，PICK1在缺血性中枢神经疾病方面的研究引起了国内外学者的高度关注，Yu等[10]研究表明，在脑缺血再灌注损伤的过程中，PICK1表达显著上调，功能性敲除PICK1基因的对缺血再灌注损伤有显著的保护作用。Dixon等[11]实验结果显示，氧气和葡萄糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）引起的AMPA受体亚单位转换依赖于PICK1蛋白的PDZ结构域，而且这种亚单位转换与OGD诱导的神经元死亡有关。

本研究通过经典的冠脉左前降支结扎法构建心肌梗死动物模型，对不同组别大鼠血清PICK1分析发现，心肌梗死后24 h外周血PICK1表达无显著变化，而在建模后的3 d时PICK1的表达显著增高，7 d时虽略有回落，但仍高于假手术组及正常对照组。与外周PICK1表达模式不同的是，心肌梗死早期心肌组织PICK1已明显上调，并且以基本相同的水平维持至实验7 d，上述研究结果表明，PICK1可能参与了心肌梗死缺血再灌注损伤的病理过程，外周血PICK1的滞后上调反应可能与心肌细胞损伤后释放有关。值得注意的是，本研究假手术组血清及心肌组织PICK1虽与正常对照组差异无统计学意义，但均略有增高，提示PICK1还可能与创伤及应激反应相关。

综上所述，PICK1作为一种功能多样的蛋白质，在心肌缺血再灌注损伤中发挥一定的作用，但具体机制尚待进一步研究。鉴于PICK1结构的特殊性，利用相互作用抑制剂特异性的调节，甚至阻断PICK1的功能，有望为缺血性心肌病的治疗带来新的曙光。

参考文献：

[1]Staudinger J， Zhou J，Burgess R，et al.PICK1：A perinuclear binding protein and substrate for protein kinase C isolated by the yeast two-hybrid system[J].J Cell Biol，1995，128（3）：263-271.

[2]Garry EM，Moss A，Rosie R，et al.Specific involvement in neuropathic pain of AMPA receptors and adapter proteins for the GluR2 subunit[J].Mol Cell Neurosci，2003，24：10-22.

[3]Opitzt，Grrooms SY，Bennett MV，et al.Remodeling of alpha-amino -3-hydroxy-5- methyl-4-isoxazole-propionic acid subunit composition in hippocampal after global ischemia[J].Proc Natl USA，2000，97：13360-13365.

[4]Hong CJ，Liao DL，Shih HL，et al.Association study of PICK1 rs3952 polymorphism and

schizophrenia[J].Neurorepert，2004，15（12）：1965-1967.

[5]Lin WJ，Chang YF，Wang WL，et al.Mitogan-stimulated TIS21 protein interacts with a

protein-kinase-Calpha-binding protein rPICKl [J].Biochem J，2001，354（Pt 3）：635-643.

[6]Campbell DJ，Kladis A，Valentijn AJ.Effects of losartan on angiotenainand bradykinin peptides and ongiotemin-converting enzyme[J].J Cardiovasc Pharmacol，1995，26（2）：233-240.

[7]Takeya R，Takeshige K，Sumimoto H.Interaction of the PDZ domain of human PICK1 with

class I ADP ribosylation factors[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，267：149-155.

[8]Boudin H，Craig AM.Molecular determinants for PICK1 synaptic aggregation and

mGluR7a receptor coclustering：Role of the PDZ，coiled-coil，and acidic domains[J].J Biol Chem，2001，276（32）：30270-30276.

[9]Hruska-Hageman AM，Wemmie JA，Price MP，et al.Interaction of the synaptic protein PICK1（protein interacting with C kinase 1） with the non-voltage gated sodium

channels BNC1（brain Na+ channel 1） and ASIC（acid-sensing ion channel）[J].Biochem J，

2002，361（Pt3）：443-450.

[10]Yu DF，Wu PF，Fu H，et al.Aging-related alterations in the expression and distribution of

GluR2 and PICK1 in the rat hippocampus[J].Neurosci Lett，2011，497（1）：42-45.

[11]Dixon RM，Mellor JR，Hanley JG.PICK1-mediated glutamate receptor subunit

2（GluR2）trafficking contributes to cell death inoxygen/glucose-deprived hippocampal neurons

[J].J Biol Chem，2009，284：14230-14235.