总黄酮提纯工艺探究

作者：郭晓青 吴金鸿 周焱富 王正武 杨科峰 单位：上海交通大学农业与生物学院 贵阳护理职业学院 福州大学生物科学与工程学院 上海交通大学医学院营养系

1材料与方法

1.1材料与试剂明日叶由上海交通大学农业与生物学院种植实验基地提供。AB-8大孔树脂、DM130大孔树脂、HP-20大孔树脂，芦丁标准品（纯度>98%）上海融禾医药科技有限公司，95%乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠均为分析纯。

1.2仪器与设备RT-25粉碎机北京兴时利和科技发展有限公司；DK-S26电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司；AG823LC7-NRHE微波炉广东美的微波炉制造有限公司；离心机Centrifuge5810Reppendorf；DU800uv/visSpectrophotometerBeckmanCoulter，USA；SHA—B双功能水浴恒温振荡器金坛市科析仪器有限公司；DHL-B电脑恒流泵上海青浦沪西仪器厂；旋转蒸发器水浴槽上海青浦沪西仪器厂；FD-1A-50冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司。

1.3方法

1.3.1明日叶水溶性总黄酮含量测定

1.3.1.1标准曲线绘制准确秤取芦丁标准品5mg，用95%乙醇溶解，并定量转移至25mL棕色容量瓶中，配成0.20mg/mL的芦丁标准溶液。准确取芦丁标准溶液（0.2mg/mL）0.00、0.20、0.40、0.60、1.00、1.20mL，分别置于10mL容量瓶中，加入5%NaNO20.4mL，摇匀，放置6min，再加入10%Al（NO3）30.4mL，摇匀，放置6min，再加入5%NaOH4mL，加水至刻度，摇匀，放置15min，以试剂空白作为参比，在510nm处测定吸光度A，以芦丁浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线[9-10]，得到芦丁吸光度与浓度的标准曲线回归方程y=6.7558x-0.0036R2=0.9942。芦丁浓度在0—0.024mg/mL范围内呈现良好线性关系。

1.3.1.2明日叶水溶性总黄酮含量测定取1mL样品液，稀释10倍，再取1mL稀释液，按标准曲线建立的方法测定吸光度，根据公式（1）求出样品液总黄酮含量。

1.3.2明日叶水溶性总黄酮粗提液制备将干燥明日叶粉碎至80目以下。明日叶粉按料液比1：10与去离子水混合，搅拌均匀，采用水浴加热浸提、直接加热煮沸浸提、微波辅助浸提三种方法浸提，浸提液冷却至室温后8000r/min离心10min，应用1.3.1.2测定方法测定上清液总黄酮含量，按公式（2）计算相应提取率。比较结果，选择最佳浸提方法。

1.3.3.1树脂的预处理用95%的乙醇将大孔树脂浸泡24h，充分膨胀后，用乙醇洗至洗出液加适量的水无白色浑浊，再用去离子水洗去乙醇；然后用5%的HCl溶液浸泡5h，再用去离子水洗至中性；最后用5%NaOH溶液浸泡5h，再用去离子水洗至中性，然后浸泡在去离子水中备用[11]。

1.3.3.2大孔树脂筛选对AB-8、DM130与HP-20三种大孔树脂[11-12]，进行静态吸附及解吸实验，比较确定较理想的大孔树脂。具体实验步骤如下：分别取2g经预处理的树脂置于锥形瓶中，加入加入质量浓度为1.557mg/mL样液50mL，置于18℃水浴恒温震荡器上震荡12h，充分吸附后将样液静置10min，按1.3.1.2测定上清液中的水溶性总黄酮浓度，再根据公式（3）与公式（4）分别计算总黄酮吸附量和吸附率。将上述吸附饱和的大孔树脂用蒸馏水洗至洗脱液无色，滤纸吸干树脂表面残留溶液，加入95%乙醇50mL，置35℃水浴恒温震荡器震荡12h，充分解吸后将样液静置10min，测定洗脱液中总黄酮浓度，根据公式（5）计算解析率。

1.3.3.3大孔树脂提纯工艺的优化用湿法将10mL树脂装入层析柱（1.6cm×20cm）中，取质量浓度为2.445g/mL的一定体积的明日叶水溶性总黄酮粗提液，以1mL/min流速上样，每1BV收集一份流出液，测定每份流出液中总黄酮含量，绘制泄露曲线，确定最佳上样量。以最佳上样量上样，测定洗脱液最佳pH值、最佳洗脱浓度以及最佳洗脱用量。

1.3.4明日叶水溶性总黄酮提纯产物分析在最佳的提纯工艺条件下，收集大孔树脂洗脱液，将其旋转蒸馏浓缩，冷冻干燥，得到提纯产物。测定提纯产物样品中紫外吸收光谱（波长测定范围：200-510nm）、总黄酮含量、总糖含量[13]，并分析测定其特征性显色反应[14]以初步判断其所含的黄酮类别。

1.3.5数据处理实验数据以三个独立重复实验的平均值表示，实验结果采用t检验进行统计分析，p<0.05时具有显著性差异，p<0.01时具有极显著性差异。

2结果与分析

2.1明日叶水溶性总黄酮的浸提方法

2.1.1水浴加热浸提对明日叶水溶性总黄酮提取率的影响在不同的浸提温度和浸提时间的条件下水浴加热浸提得到的粗提液水溶性总黄酮提取率分析结果分别见图2和图3。由图2可知，水浴加热浸提10min，随着温度升高浸提液中水溶性总黄酮提取率升高，温度达到75℃,总黄酮提取率显著增加（p<0.05）,95℃时总黄酮提取率达到最大值，为2.52%。由图3可知，在水浴95℃条件下浸提，随着加热时间增加，总黄酮提取率先增加，浸提10min时浸提液总黄酮提取率达到最大值(p<0.05)，随后总黄酮提取率逐渐降低。因此，水浴加热浸提的最佳条件是95℃水浴加热10min。

2.1.2加热煮沸浸提对明日叶水溶性总黄酮提取率的影响由图4可知，随着煮沸浸提时间增加，总黄酮含量先增加，沸腾状态下浸提5min时浸提液总黄酮含量显著增加（p<0.05），随后增加趋缓，5min—10min（p>0.05）,浸提10min后总黄酮含量显著降低(p<0.05)。因此，直接加热煮沸最佳浸提时间是5min。由结果可以看出，95℃水浴加热10min浸提提取率最大。同时，两种方法浸提10min后浸提液中总黄酮提取率反而降低。这是因为黄酮苷元本身难溶于水或不溶于水，但当引入羟基或糖苷变成黄酮苷类物质后后极性增大，在水中溶解度增加[14]。明日叶中含有较多的水溶性黄酮糖苷类物质，但在较高加热温度下，加热时间过长时容易使黄酮糖苷类发生了水解，转化为黄酮苷元，从而降低了在水中的溶解度，导致水溶性黄酮含量减少。同时黄酮苷类的水解情况根据糖的种类和链接在糖的母核上的位置不同而不同，有的水解只需几分钟，而有的则需几小时[14]，这也是不同浸提时间增加，水溶性黄酮提取率不同的主要原因。

2.1.3微波辅助浸提对明日叶水溶性总黄酮提取率的影响据有关文献报道，加热浸提后再进行微波辅助提取，黄酮提取率会大幅度增加[15]。95℃水浴加热10mim后，进行微波辅助浸提，实验结果见图5。由图5可知，95℃水浴加热10mim后，再进行微波辅助提取，总黄酮提取率没有明显增加（p>0.05），而且助提3次后总黄酮含量还明显降低了（p<0.05）。综合以上实验结果，结合经济效益与提取率等因素，本文确定最适的浸提方法为水浴加热浸提，最佳浸提条件为浸提温度为95℃，浸提时间为10min。#p#分页标题#e#

2.2明日叶干粉水溶性总黄酮测定

称取5克明日叶（去除根茎）粉末放入烧杯中，加入50mL去离子水，搅拌混合均匀，将烧杯置于水浴锅中，然后在95℃的浸提温度下搅拌水浴浸提10min，冷却至室温，在8000r/min离心10min，取离心上清液。再将沉淀洗涤三次，同样条件离心，合并上清液，测定总黄酮含量，得出明日叶总黄酮含量为3.74%。

2.3大孔树脂提纯化明日叶水溶性总黄酮的工艺

2.3.1树脂筛选选取文献[16-18]中对分离黄酮类化合物作用较好的3种大孔树脂(DM130、HP-20、AB-8)按1.3.2.2方法，对明日叶水溶性总黄酮粗提液进行静态吸附及解吸实验，实验结果见表1。从表1可知，与其他两种树脂比较，HP-20大孔树脂对明日叶水溶性总黄酮的吸附量和吸附率都最高，吸附量达31.30mg/g，吸附率达到80%，解吸率也最大，达到32%，因此选择HP-20大孔树脂对明日叶水溶性总黄酮进行提纯。

2.3.2最佳上样量确定由图6可知，第1个和第2个BV泄露较少，第3个BV开始泄露较多一点，但此时树脂吸附较少，第4个柱体积后样液泄露明显增加，且含量超过5mg。因此综合泄露情况和树脂吸附情况，确定当粗提液浓度为2.445mg/mL时，最佳上样量为4个BV（即40mL）比较合适。

2.3.3洗脱液pH测定最佳上样量（4BV）上样，用100mL80%乙醇洗脱，调节洗脱液pH值，测定在pH值分别为2、3、4、5、6时洗脱液中总黄酮含量，测定结果见图7。由图7可知，随着pH值的降低，洗脱液中总黄酮含量明显提高，当pH值为3时，洗脱液总黄酮回收率急剧增加（p<0.01），当pH值为2时达到最大值59.9。但如果pH值再降低，即洗脱液酸性过强，可能会对黄酮苷类物质性质产生影响，如发生酸水解等。因此洗脱液最适pH值为2。

2.3.4洗脱液浓度测定最佳上样量上样，用100mL乙醇洗脱，pH值调至2，调节乙醇浓度，测定不同乙醇浓度的洗脱液中总黄酮含量，结果见图8。由图8可知，洗脱液乙醇浓度达到70%时洗脱液总黄酮含量最大，洗脱液总黄酮回收率为61.85%（p<0.05）。所以确定乙醇洗脱液适宜浓度为70%。

2.3.5洗脱液用量测定最佳上样量上样，用70%乙醇（pH调至2）洗脱，1BV收集一份，测出每份洗脱液中总黄酮含量，测定结果见图9。由图9可知，第一份柱体积总黄酮含量最大，然后逐渐降低，第8份洗脱液已经几乎不含有总黄酮含量，所以最佳洗脱用量为8BV。

2.3.6最佳提纯工艺条件综上所述，应用HP-20大孔树脂对明日叶水溶性总黄酮进行动态的提纯，其最佳提纯工艺条件为：质量浓度为2.445mg/mL样液最适上样量为4BV，乙醇洗脱液最适pH值为2，适宜浓度为70%，最佳洗脱用量为8BV。

2.4明日叶水溶性总黄酮提纯产物分析

在最佳提纯工艺条件制备明日叶水溶性总黄酮提纯产物，即：取2.445mg/mL样液40mL（4BV），总黄酮含量97.8mg。以2mL/min上样，用60mL（6BV）水洗涤，再用80mL（8BV）70%乙醇（pH调至2）洗脱，测定洗脱液总黄酮含量。重复三次取平均值，测得洗脱液总黄酮含量为60.76mg，回收率达到62%。将洗脱液旋转蒸馏，冷冻干燥，得到明日叶水溶性总黄酮提纯产物，按1.3.1.2方法测定其所含总黄酮含量，计算得到提纯后的样品中含量为29.2%，比明日叶干粉的含量提高了约6.8倍。提纯产物进行了紫外-可见波长扫描，结果图10。从结果可见，提纯产物在200-350nm范围有黄酮类物质特征性两个吸收带，在200-280nm区域吸收带与黄酮物质中苯甲酰生色团有关，在300-400nm区域吸收带与肉桂酰生色团有关。应用苯酚-硫酸法测定总糖，粗提物中总糖含量15.57%，而提纯产物中总糖相对含量提高到35.57%。结果说明提纯产物中的黄酮苷类可能含黄酮糖苷。对提纯产物与三氯化铝、三氯化铁、醋酸铅试剂进行显色反应，显色结果见表2。根据表2显色结果推断提纯产物中黄酮类物质可能的结构表明，提纯产物所含有的黄酮类物质可能含有酚羟基、邻二酚羟基或3-OH、4-酮基，5-OH、4-酮基等结构[14]。

3结论

3.1本文对水浴加热浸提、直接加热煮沸浸提、微波辅助提取三种方法进行试验，确定明日叶水溶性总黄酮提取最佳方法是水浴加热浸提，最佳浸提条件为水浴温度95℃，加热时间10min。

3.2本文利用大孔树脂对明日叶水溶性总黄酮粗提液进行提纯。通过静态吸附-解吸实验，结果表明，HP-20大孔树脂对明日叶水溶性总黄酮具体良好的提纯效果；动态实验下，其最佳的提纯工艺条件为：上样量为4BV，乙醇洗脱液浓度为70%，pH值为2，洗脱用量为8BV。

3.3在最佳的提纯工艺条件下制备的产物中黄酮的含量由明日叶干粉的3.74%总黄酮含量提高到29.2%，提高了7.81倍，说明提纯效果很好。提纯产物在200-400nm范围有黄酮类物质特征性两个吸收带，总糖含量由粗提物的15.57%总糖含量提高到35.57%，同时与三氯化铝、三氯化铁、醋酸铅试剂进行显色反应分别显示黄色、蓝黑色和黄色沉淀，说明提纯产物可能含有酚羟基、邻二酚羟基或3-OH、4-酮基，5-OH、4-酮基等结构特点的黄酮糖苷类物质。