TAL效应蛋白研究进展

摘要 介绍了TAL效应蛋白相关的研究进展，包括TAL效应蛋识别DNA，其在基因工程上的应用，TALENs中DNA结合域的设计和组装，并对未来发展趋势进行分析和展望，以期为TALENs技术的发展与应用提供参考。

关键词 TAL效应蛋白；TALENs；靶向DNA；基因工程

中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）05-0274-02

Research Advances on TAL Effect Protein

HE Hua-lan

（College of Life Sciences，Fujian Normal University，Fuzhou Fujian 350108）

Abstract The related research advances on TAL effect protein were introduced，including TAL effect protein identification of DNA and application in genetic engineering，design and assembly of DNA binding domain in TALENs.The future developing trend was analyzed and prospected，so as to provide references for development and application of TALENs technology.

Key words TAL effect protein；TALENs；targeting DNA；genetic engineering

细胞通过合适的DNA结合蛋白来控制表达、复制和传输遗传物质。在活细胞中以靶向方式改变核苷酸序列和基因表达是有难度的，实现所需的特异性面临挑战。植物病原细菌的类转录激活因子效应物包含一个模块化DNA结合结构域，似乎克服了这一困难。在DNA中包括串联式、多态氨基酸重复的个别特定连续的核苷酸，这些领域正在向目标DNA展开中，应用范围从模式生物中了解基因功能到在作物中改善性状以及人类治疗遗传性疾病。

从生物学已经在寻找控制细胞中的遗传信息，通过DNA靶向工程中的DNA结合域与新的序列特异性融合它们到蛋白质中从而改变DNA及其表达。锌指结构域主要识别三核苷酸，已经被广泛使用。锌指结构的排列组合到识别不同长度的上游目标基因已经被融合至转录激活或抑制蛋白质，目的是创建人工基因调控子[1]并且序列特异性的锌指核酸酶（ZFNs）也已经创建，通过定向染色体分离，能够定向突变和基因组的编辑[2]。虽然在DNA靶向与锌指结构中已经取得了相当大的进步[3]，但其广泛应用已经被资源密集型和新兴市场获得新的DNA序列特异性阻碍。转录激活元件（TAL）效应蛋白以一种明显的模块方式识别DNA，也就是更多的是接受DNA定位：串联，多聚氨基酸重复在这些蛋白质中独立的特异性，在DNA定位中连续的核甘酸。然而发现仅在植物病原细菌中，特别是黄单胞菌属，TAL效应蛋白成员是转录领域，活性转录激活因子。通过细菌型Ⅲ分泌系统注射进植物细胞，导入到植物细胞核中并且定位特异性效应物基因启动子[4-5]。TAL效应蛋白结合激活下游基因的表达，导致细菌克隆、症状形成及病原体传播。通过开拓TAL效应蛋白-DNA，识别DNA靶向控制体内遗传物质。

1 TAL效应蛋白识别DNA

TAL效应蛋白重复的氨基酸集中位于蛋白质的靶向结构域，通常由34个氨基酸组成。大多数TAL效应蛋白有13～28个重复[6]。这34个氨基酸中除了第12～13位的氨基酸变化较大之外，其他氨基酸高度保守。这2个不保守的氨基酸被命名为重复可变区（repeat variable diresidue，RVD）。不同的TAL效应子都具有相同的NLS及AD，只是其重复可变区的重复数目和重复类型不同，并决定其与寄主识别的特异性。每个重复序列中12～13位的氨基酸和被识别的核苷酸种类有特殊的一一对应关系。不同的RVDs都有选择地与不同的核苷酸链接。一般地，TAL效应子每个重复单元的第12～13位双链氨基酸识别DNA碱基的规律为：NG识别T，HD识别C，NI识别A，NK或NN识别G[7]。因此，重复数（包括最终，截断重复）和一串RVDs包含决定长度和组成这些目标序列的核苷酸被识别。然而尚未报道TAL效应蛋白结合的DNA结构，但据推测RVDs特异性地与核苷酸（或者碱基对）接触让目标被识别。RVD核苷酸组织不是唯一的，并且大多数TAL效应蛋白/DNA碱基对在自然界中存在不匹配；然而最常见的组织持续由TAL效应结合位点编码其中TAL效应蛋白结合位点可被预测，目标位点的合成到结合特定TAL效应蛋白[8]，和定制的TAL效应重复阵列组装到可选择的目标DNA序列。此外，被RVDs指定的核苷酸序列一致出现在目标DNA的1个T之前，这是TAL效应蛋白活性必需的。已经提出了蛋白质部分在重复区域之前就相互作用并且指定了这些T，因为它显示了与预测的二级结构类似的重复，但它不包含可识别的RVD[9]。

2 TAL效应蛋白在基因工程中的应用

TAL效应蛋白目标域可用于直接催化FokⅠ核酸酶的结构域，作为融合蛋白，为了创建位点特异性DNA双链缺口（DSBs）。由于FokⅠ的功能作为一个二聚体，例如TAL效应蛋白核酸酶（TALENs）以成对的形式被设计在结合对方的DNA靶位点通过间隔分开，从而允许FokⅠ单体结合形成DSB，激活细胞的DNA配对途径，利用形成特异性DNA序列修饰或者临近的缺口位点[2]。大部分细胞中，DSBs被1/2个高度保守的加工过程修复。在非同源末端连接（NHEJ）被切断的染色体可能会不严密地结合，导致在断裂部位小的插入或缺失，从而干扰基因功能。在同源重组（HR）中，该DNA周围的缺口位点被类似序列的模板所修复。修复模板的序列可以在特定突变或额外序列中修改或修订（DNA的编辑）。基于NHEJ和HR修改的基因组修饰在不同动物和植物物种中频率很高，利用ZFN和工程化家族内切酶，后者移动的元素获得的酶识别12～40个碱基对（bp）并且具有被改造的新DNA序列特异性[10]。

人们已经证明了在酵母质粒获得目标物中TALEN的活性，利用在DNA识别序列报告基因中的2个重叠片段之间被替换的分析[11]，如果目标被切开，随后通过修复单链退火加入重叠片段并重新组成的报告基因，提供了一个TALEN活性的定量读数。虽然TAL效应与随机重复组装排列已被证明其功能可作为转录活化剂与对应的合成靶序列[8]，所述酵母的试验证明即重复排列可定制针对感兴趣的特定序列，在这种情况下基因序列来自拟南芥和斑马鱼[11]。

另一个里程碑是实现自定义的TALENs被证明通过NHEJ在位点定向诱变和在培养内源性染色点人胚肾细胞中通过HR基因打靶[12]。NHEJ的突变效率高达25%，这些标准在ZFN中观察到。由于这一具有里程碑意义获得，TALENs已被成功地用于多种试验系统。TALEN介导的基因打靶在人胚胎干细胞的5个位点和诱导多能性干细胞中被证明，再次与ZFNs效率 一样。对于植物而言，TALENs却显示出了一个切割瞬时导入，游离目标在烟草叶片中[13]，和NHEJ介导的位点定向诱变是在拟南芥原生质体中的一种内源性基因座中获得的[14]。在酵母中，TALENs启用高效率的基因置换的几个染色点[15]。在秀丽隐杆线虫和其亲缘的C.briggsae，为此基因打靶方法还有所欠缺，TALEN或ZFN的mRNA注入性腺导致在内源靶基因中3%～5%的后代伴随着突变[16]。利用TALENs，体细胞和在斑马鱼中的遗传基因敲除已被使用[17-18]，并且IgM通过显微注射胚胎TALEN DNA或mRNA的构建体[19]敲除鼠已经产生。

一般涉及的基因组工程靶蛋白可能诱变意想不到的位点，尤其在人类治疗的情况下，脱靶活性会带来灾难性的后果[20]。甚至在植物和动物中，可以删除不需要的突变。TALEN特异性受2个结合位点的间隔长度影响从而产生切口，取决于TALEN体系结构，已经报道6～40 bp的间隔长度的功能。但对于所有这些结构，TALENs切割在一系列间隔长度范围在10～30 bp附近有最佳的位点。与此相反，ZFNs有许多更明确的间隔长度的要求[21]。TALEN间隔长度功能的范围表明，灵活性是由靶向域下游的TAL效应蛋白序列提供，允许FokⅠ单体在不同距离的二聚化。虽然有几种不同的TAL效应蛋白的衍生物不同的序列N-和C-末端截短的在目标域周围的已经被测试，较大的蛋白质是DNA结合必不可少的最小部分，DNA结合尚未被系统地分隔。包括最小的DNA结合结构域的一个结构和一个长度优化的连接体都可能会导致减小间隔物长度的范围从而提高了特异性。

3 TALENs中DNA结合域的设计和组装

目前已经开发出多种合成与组装TALENs中DNA结合域的方法。这些方法的基本核心是合成TAL效应子串联重复区的编码DN段，采用的策略主要有2种：一是全长DN段的重新合成；二是用酶切-连接的所谓“金门（golden gate）”策略对TAL效应子的天然重复序列模块进行组装。串联重复区的编码DN段合成后，将其克隆到含有TAL效应子N-端、C-端和FokⅠ切割域编码序列的载体上，即构建成TALENs表达基因盒。

3.1 靶位点选择

TALENs识别的靶位点DNA序列一般在12 bp以上，一对TALENs的2个识别靶位点之间的DNA序列最好在16～21 bp。靶位点可以是目标基因的启动子序列（调控基因表达水平），也可以是第一外显子（基因失活）。Cermak et al[22]列出了选择靶位点的几个原则，其中一个必须遵循的原则是TALENs识别DNA靶位点上游的那个碱基一定是T。

3.2 TALENs的合成

靶位点选定后，就根据靶位点DNA序列碱基合成对应的TAL效应子串联重复区进行合成。试剂盒为PCR扩增和酶切提供模块化重复单元，酶切后获得的每个重复单元的5′-和3′-都带有特异的粘性末端，该粘性末端可以保证不同的重复单元按照设计顺序进行连接。一般情况下，10个以内的不同重复单元可在一个反应中按设计顺序连接，这些连接起来的片段可以在下一个反应中连接成更长的串联重复区，直到满足TALENs的设计需要。

4 展望

TALENs技术仍然存在一些问题。例如TALEs蛋白分子量比ZFNs要大很多，过大的TALENs蛋白就会给分子操作带来不便，不但会增大与靶基因结合的难度，而且在生物体内也可能产生其他影响。那么除去TALENs的不必要部分，就能够设计出用于病毒载体并且特异高效表达的TALENs，从而扩大TALENs的应用领域。此外，通过长短不同的TALENs识别位点，提高TALENs的特异性，从而降低其细胞毒性。总之，TALENs技术出现的时间并不长，但是发展速度比较快。目前，TALENs的活性已经在体外以及包括酵母、植物和哺乳动物等物种中得到验证，将来有可能发展成为一种操作方便、特异性强、切割效率高、并能应用于各种生物的基因组定点操作技术。

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