4―羟基苯乙酸对酪氨酸酶作用机理研究

摘 要：本实验研究了4-羟基苯乙酸对酪氨酸酶的作用机理。实验结果表明：在低浓度条件下，4-羟基苯乙酸对酪氨酸酶具有激活抑制作用；在高浓度条件下，4-羟基苯乙酸对酪氨酸酶具有抑制作用。

关键词：酪氨酸酶 4-羟基苯乙酸 激活作用

中图分类号：Q356.1 文献标识码：A 文章编号：1674-098X（2013）01（a）-00-01

酪氨酸酶（Tyrosinase），又称多酚氧化酶，是一种含铜金属酶，广泛存在于细菌、真菌、裸子植物、被子植物、哺乳动物等生物中，并存在于生物界系统发育阶段的各个水平。一般认为，羽毛，毛发，眼睛，昆虫表皮，种子等呈现出黑色、褐色、浅黄色等色素，都是酪氨酸酶作用的结果。酪氨酸酶的产物黑色素具有抗紫外线、清除自由基、抗病毒等重要功能。最新研究结果表明，可利用黑色素制备相应的抗体来治疗与酪氨酸酶表达相关的疾病。因此，国内外很多学者都致力于寻找具有特异的、高效的酪氨酸酶作用物，研究其抑制或激活的作用机理和动力学。该文以4-羟基苯乙酸作为效应物，研究其对酪氨酸酶催化反应的影响及作用动力学，得到有关动力学参数，为酪氨酸酶抑制剂和激活剂的分子设计的实际应用提供理论依据。

1 实验方法

1.1 材料及仪器

蘑菇酪氨酸酶（Mushroom tyrosinase）购于Sigma公司，总活力为50 KU。L-3，4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）购于上海斯高勒生物技术有限公司。对羟基苯乙酸、磷酸氢二钠（Na2HPO4）和磷酸二氢钠（NaH2PO4）等试剂均为国产分析纯。仪器为上海UNICO公司UV-2102PC型紫外可见分光光度计。

1.2 酪氨酸酶酶活测定

以1.0 mM L-DOPA为底物。先将0.6 mL 5 mM的L-酪氨酸（溶于pH 6.8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液）溶液置于石英比色皿中，加入2.28 mL pH 6.8的Na2HPO4- NaH2PO4缓冲液，置于30 ℃恒温水浴中恒温10 min，加入90 μL含不同浓度的4-羟基苯乙酸溶液和0.8 mg/mL酪氨酸酶水溶液，测定OD475。此测活体系中，酶的终质量浓度为1.0 μg/mL。

2 结果与讨论

2.1 4-羟基苯乙酸对酪氨酸酶的影响

如图1所示，固定酪氨酸酶催化反应体系中的终质量浓度为0.55 μg/mL，底物L-DOPA的浓度为1.0 mmol/L。结果表明，在4-羟基苯乙酸浓度在10.0 mmol/L以内，对酪氨酸酶催化氧化L-DOPA起激活作用，并且激活作用随4-羟基苯乙酸浓度的激活程度是先增加后下降，在2.0 mmol/L浓度左右，酶催化活力变为原来的2.4倍。当酶催化反应体系中4-羟基苯乙酸的浓度超过10 mmol/L，4-羟基苯乙酸对酪氨酸酶起抑制作用，当4-羟基苯乙酸浓度为15.0 mmol/L时，酶催化活力变为原来的20%。

2.2 4-羟基苯乙酸对酪氨酸酶作用机理分析

黑色素的合成途径一般被分为两个阶段：远端步骤和近端步骤。近端步骤包括单酚和/或邻-二酚的酶氧化，由含铜酪氨酸酶催化形成邻醌；远端步骤包括化学反应和酶反应，最终合成黑色素。（见图2）

在双酚酶催化循环中，还原态酶（Emet）与双酚（D）非共价结合，双酚上的羟基被亲核试剂进攻释放出2个H+，生成的复合物Emet-D分解释放出醌（Q）、水和脱氧态酶（Edeoxy）。

Edeoxy结合氧气生成氧化态酶（Eoxy），Eoxy可结合单酚也可以结合双酚，结合双酚后继续进行双酚循环，双酚与氧化态酶非共价结合，双酚上的羟基被亲核攻击，释放出2个H+，同时双酚与铜离子形成分子轨道共面，研究已表明，分子轨道共面对于氧化还原反应的发生是必需的，生成复合物Emet-D并分解释放出酪、水和还原态酶，完成循环双酚在此循环中不断被氧化成为醌，如图所示。

3 结语

通过酶动力学手段，筛选酪氨酸酶高效的激活剂4-羟基苯乙酸，并总结出相关的构效关系，为进一步设计和改造得到新型高效的酪氨酸酶作用物奠定了基础。