中试规模和不同提取时段的黄芩配方颗粒质量参数在线NIR监测研究

[摘要]采用近红外光谱分析技术，在线监测黄芩配方颗粒提取过程中黄芩苷成分的含量变化。以高效液相色谱法为参考方法，采用Kennard-Stone法（KS）划分样本集，进而比较不同预处理方法，通过组合间隔偏最小二乘法（SiPLS）对建模波段进行筛选，建立偏最小二乘模型。采用相对误差法对黄芩3次提取时段的预测集样本进行预测。结果表明应用Savitzky-Golay11点平滑（SG11点）预处理方法所建模型最好，其交叉验证均方根（RMSECV）、校正均方根误差（RMSEC）和预测均方根误差（RMSEP）分别为0.092 7，0.134 4，0.114 8，决定系数R2均大于0.99，且黄芩苷含量的平均相对误差在5%以下，说明在线近红外光谱分析技术可以应用于黄芩配方颗粒提取过程中在线监测及其质量控制。

[关键词]黄芩；配方颗粒；在线近红外；组合间隔偏最小二乘；过程监测

中药配方颗粒是中药现代化生产的重要产物之一，是单味药材经过提取、浓缩、醇沉及后续制剂过程后形成的中药产品，其具有免于煎煮、携带方便以及安全卫生等优点。在我国已有超过300多种中药材被6家企业先行生产，供临床中医应用，并取得显著效果。

黄芩作为一种常用中药材，出自《神农本草经》，为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根[1]，性味苦寒，归肺、胆、脾、大肠和小肠经，有清热燥湿、泻火解毒及止血安胎等功效。其主要成分黄芩苷是从黄芩根中提取分离出来的一种黄酮类化合物[2]，具有抑菌、利尿、抗炎、抗变态和解痉作用[3]，同时具有较强的抗癌反应等生理效能[4]。黄芩不仅在中药方剂中配伍应用普遍，而且在配方颗粒生产中为常用中药种类。目前，配方颗粒的研究热点之一主要集中在其质量检测标准和提取工艺优化等方面，未有对黄芩配方颗粒生产过程中的关键环节――提取环节质量进行实时监测的文献报道。

近红外光谱技术具有快速、无损和实时分析等优点，凭借其与光纤的结合，已广泛应用到中药生产过程中，实时监控中药生产中关键工艺参数变化，控制产品质量。通过与化学计量学结合并建立相应的近红外校正模型，近红外光谱技术可以在线智能预测生产过程中各成分的含量变化，为中药现代化生产提供一种快捷检测手段。

因此，本文采用黄芩配方颗粒的提取过程作为研究对象，以2010年版《中国药典》中规定的黄芩指标性成分黄芩苷为监测指标，实时在线采集黄芩提取过程中近红外光谱信息。以高效液相色谱法（HPLC）作为参考方法，运用组合间隔偏最小二乘法（SiPLS）进行建模波段筛选，建立黄芩苷校正模型并对其进行相对误差分析，为实现黄芩配方颗粒提取过程在线质量控制提供科学合理的手段。

1 材料

XDS Rapid Liquid Analyzer近红外光谱仪及其透射光纤（美国Foss公司），VISION工作站（美国Foss公司）；夹套式100 L多功能提取罐（天津隆业中药设备有限公司）；Waters 2695高效液相色谱仪及其Waters2996二极管阵列检测器（美国Waters公司）。

黄芩药材（北京本草方源药业有限公司）；黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号110715-201004）；甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；提取用水为自制高纯水。

2 方法

2.1 黄芩饮片的中试提取过程

称取黄芩饮片6 kg置于100 L夹套式多功能提取罐中，加12倍水，提取3次，每次1 h。在提取过程中每隔一定时间在线采集近红外光谱，同时进行HPLC离线检测。

2.2 在线NIR采集光谱

在光程2 mm下，通过光纤附件在线采集提取液吸收光谱，光谱范围为800～2 200 nm，每个样品扫描32次。

光谱采集条件如下：第1次提取过程中，提取液沸腾后每4 min采集光谱1次；第2次提取过程中，提取液沸腾后每5 min采集光谱1次；第3次提取过程中，提取液沸腾后每5 min采集光谱1次。上述过程共收集到39份样品。

2.3 提取液中黄芩苷的HPLC测定方法

2.3.1 色谱条件[1] DIKMA Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；流动相甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2），等度洗脱；柱温30 ℃；检测波长280 nm；流速1.0 mL・min-1；进样10 μL。

2.3.2 对照品溶液的配制 取在60 ℃下减压干燥4 h的黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含104 μg的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的配制 由于供试品原液浓度较大，需要对原液进行如下稀释：第1次提取煮沸阶段，取0.5 mL样品原液于25 mL量瓶中，加入20%甲醇稀释至刻度，用0.45 μm滤膜滤过，取滤液，即得；第2次提取煮沸阶段，取0.5mL样品原液于25 mL量瓶中，加入20%甲醇稀释至刻度，用0.45 μm滤膜滤过，取滤液，即得；第3次提取煮沸阶段，取2 mL样品原液于25 mL量瓶中，加入20%甲醇稀释至刻度，用0.45 μm滤膜滤过，取滤液，即得。

2.4 数据处理和软件

采用Kennard-Stone法（KS）划分39个样本集，划分后的校正集和验证集分别为26和13。采用不同的预处理方法，建立全波段偏最小二乘（PLS）模型，以交叉验证均方根（RMSECV）作为评价指标，选出最优预处理方法。采用组合间隔偏最小二乘法（SiPLS）对建模波段进行筛选，建立偏最小二乘模型，评价参数为交叉验证均方根（RMSECV）、校正均方根误差（RMSEC）、预测均方根误差（RMSEP）及其相应决定系数R2。为进一步验证模型可靠性，采用相对误差法对模型进行评价。上述数据处理均在Unscrambler数据分析软件（version9.6，挪威CAMO 软件公司）和MATLAB（version7.0，美国Math Works公司）软件上完成。

3 结果与讨论

3.1 提取液中黄芩苷的HPLC测定结果

参照文献色谱条件，其分离度、精密度、重复性和稳定性均符合分析要求。对黄芩苷进行线性条件考察，其在0.208～2.08 μg，线性关系良好，方程为Y=3×106X-23 611，R2=0.999 0。39份样品含量测定结果见表1。

3.3 光谱预处理方法筛选

在建立偏最小二乘（PLS）模型前，需要对样品的原始吸收光谱进行预处理，以消除噪音和基线漂移影响等，从而提高模型的预测精度，使所得模型更加稳健。本文比较了原始光谱、一阶导数（1D）、二阶导数（2D）和Savitzky-Golay平滑法（SG）等光谱预处理方法对模型性能的影响[6-8]。采用四折内部交叉验证法，通过考察潜变量因子数对预测残差平方和（PRESS）的影响，选择合适的预处理方法。对于黄芩提取液样本，采用SG11点平滑预处理方法所建的PLS模型PRESS值最小，所得结果较其他方法均理想，见图2。因此，采用SG11点平滑法建立黄芩苷PLS模型。

3.4 建模波段选择

由于近红外光谱存在谱带冗余信息，因此在建模之前需要对建模波段进行优化筛选。本文采用SiPLS法筛选黄芩苷最优建模波段。SiPLS法主要用于筛选PLS建模的波段，将精度较高的几个局部模型组合，以组合模型的RMSECV值作为模型精度衡量标准，选出最佳子区间组合[9]。筛选过程参数为：间隔数20，最大潜变量因子数10，组合数3。应用SiPLS法，黄芩苷最优波段为1 290～1 360 nm，1 360～1 430 nm和1 500～1 570 nm，见图3。

3.5 模型建立与预测

对样本校正集采用SG11点平滑建立偏最小二乘模型，采用内部样本集对模型预测性能进行验证，模型评价参数如下：交叉验证均方根（RMSECV）为0.092 7，校正均方根误差（RMSEC）为0.134 4，预测均方根误差（RMSEP）为0.114 8，校正集决定系数R2cal为0.995 7，验证集决定系数R2val为0.993 8，预测集决定系数R2pre为0.992 1。黄芩苷的NIR光谱预测值与参考值的相关图见图4。样品紧密的分散在直线两侧，R2均在0.99以上。为进一步验证上述模型的预测结果，采用相对误差法对所建模型预测集样本进行预测，结果表明黄芩苷在3次提取过程中其相对误差分别为3.94%，5.97%，4.03%，平均相对误差为4.74%，均低于10%，说明预测性能良好。

4 结论

本文首次采用近红外光谱技术在线监测黄芩配方颗粒不同提取时段中主要成分黄芩苷的含量变化，并建立相应的偏最小二乘模型。同时对不同提取时段的黄芩苷含量进行相对误差分析，其平均相对误差为4.74%，相对于中药黄芩说明预测结果良好。此研究可以为今后黄芩配方颗粒提取过程的质量控制与在线监测提供有力的技术支撑。

[参考文献]

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[2]于艳，徐晶，修丽丽，等.大孔吸附树脂纯化黄芩中三种黄酮的含量测定[J].中国现代应用药学，2013，30（10）：1107.

[3]汪东海，陈敏，姜志强，等.黄芩苷消除鲍曼不动杆菌耐药质粒的实验研究[J].中国现代应用药学，2012，29（5）：400.

[4]洪铁， 杨振， 绳娟， 等. 黄芩苷抗肿瘤作用及机制的研究[J]. 中国药理学通报， 2008， 24（12）：1676.

[5]Sui C， Wu Z， Peng Y， et al. Validation of NIR model for on-line monitoring of Flos Lonicera Japonica extraction process with different batches of materials[J]. Int J Online Eng， 2013， 9（4）：44.

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[8]Luypaert J， Massart D， Heyden Y. Near-infrared spectroscopy applications in pharmaceutical analysis[J]. Talanta， 2007， 72（3）：865.

[9]Wu Z， Peng Y， Cheng W， et al. NIR spectroscopy as a process analytical technology （PAT） tool for monitoring and understanding of a hydrolysis process[J]. Bioresour Technol， 2013， 137：394.

Research on quality parameters of Scutellariae Radix（formula particles）

using on-line NIR in pilot with different extraction process

LI Yang1，2，3， WU Zhi-sheng1，2，3*， Shi Xin-yuan1，2，3， PAN Xiao-ning1，2，3， ZHANG Qiao1，2，3， QIAO Yan-jiang1，2，3*

（1. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2. Pharmaceutical Engineering and New Drug Development of Traditional Chinese Medicine of

Ministry of Education， Beijing 100102， China；

3.Beijing Key Laboratory for Basic and Development Research on Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] The on-line monitor for the changes in the content of baicalin in Scutellariae Radix formula particles during the extraction process was conducted by using near infrared spectroscopy （NIR）. High performance liquid chromatography （HPLC） was used as a reference method. Kennard-Stone （KS） was used to divide sample sets， so as to compare different pretreatment methods. The synergy interval partial least squares （SiPLS） was used to screen out modeling wave band to establish partial least-squares models. The relative error method was applied to predict forecast set samples of Scutellariae Radix in three extraction phases. The results showed that the model established by Savitzky-Golay smoothing with 11 points （SG11 points） was the best， with the root mean square with cross validation （RMSECV）， root mean square error of correction （RMSEC） and root mean square error of prediction （RMSEP） of baicalin of 0.092 7， 0.134 4 and 0.114 8， respectively， the determination coefficient R2 of greater than 0.99， and the relative error of baicalin content of less than 5%. This indicates that the on-line near infrared reflectance spectroscopy could be applied in on-line monitor and quality control of the extraction process of Scutellariae Radix formula particles.

[Key words] Scutellariae Radix； formula particles； on-line NIR； SiPLS； process monitoring

doi：10.4268/cjcmm20141918