熊胆粉微生物限度检查方法学验证

[摘要] 目的 建立熊胆粉微生物限度检查方法，并对方法进行验证。 方法 采用《中国药典》2010年版一部附录ⅩⅢC微生物限度检查法对熊胆粉进行微生物限度检查。 结果 用pH 7.0的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制备样品，可采用培养基稀释法（1∶20供试液，0.1 mL/皿）进行细菌计数；采用培养基稀释法（400 mL营养肉汤）进行沙门菌检查；采用1∶10供试液的常规法进行霉菌及酵母菌计数和控制菌检查。 结论 该方法消除了样品的抑菌性，可用于该品种的微生物限度检查。

[关键词] 熊胆粉；微生物限度检查；验证

[中图分类号] R286.0 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）02（a）-0116-03

Validation on microbial limit test method of bear gall powder

YANG Wubin LI Yuanhong LAN Hong

Department of Pharmacy, Taihe Hospital Affiliated to Hubei Medical University, Hubei Province, Shiyan 442000, China

[Abstract] Objective To set up the microbial limit test ways for bear gall powder and verification of the method. Methods A microbial limits method of Chinese Pharmacopeia (2010 edition) part one appendix ⅩⅢC was used to detected the microbial limit test method of bear gall powder. Results Sodium chloride-peptone aseptic buffer solution (pH=7.0) was used to prepare the test sample. Culture media dilution (1∶20 sample solution, 0.1 mL/dish) was used to count the bear gall powder bacteria. Salmonella test method for culture media dilution method (400 mL NB) was used. 1∶10 selected liquid was adopted to do the mildew and yeast count and control bacteria inspection by the conventional method. Conclusion This method can eliminate the antimicrobial properties and it can be used for the microbial limit test for bear gall powder.

[Key words] Bear gall powder; Microbial limit test; Validation

熊胆粉为熊科动物黑熊Selenaretos thibetanus Cuvier经胆囊手术引流胆汁而得的干燥品，收载于国家药品标准《新药转正标准》第11册[1]，本品有一定的抑菌作用[2]，但其微生物限度检查一直采用常规方法检验，根据《中国药典》2010年版的要求，对原用的常规方法进行验证[3]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LDZX-40BI立式自动电热压力蒸气灭菌器（上海申安医疗器械厂），DNP-9162型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司），HH B11 600型电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂），LRH-150B生化培养箱（广东医疗器械厂），超净台（苏净集团安泰公司）。

1.2 培养基

营养肉汤培养基，改良马丁培养基，营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，胆盐乳糖培养基，甘露醇氯化钠琼脂培养基，溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB），四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB），胆盐硫乳琼脂培养基（DHL），均购自中国药品生物制品检定所。

1.3 阳性对照菌

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]，大肠埃希菌[CMCC（B）44102]，枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]，铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]，乙型副伤寒沙门菌[CMCC（B）50094]，白色念珠菌[CMCC（F）98001]，黑曲霉菌[CMCC（F）98003]，均购自四川省食品药品检验所。

1.4 供试品

熊胆粉（购自四川省新鹿药业有限公司，批号：091203、091204、091205）。

2 方法与结果

2.1 供试液的制备

2.1.1 供试液制备方法1

取供试品10 g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，混匀，作为1∶10供试液。

2.1.2 供试液制备方法2

取1∶10供试液25 mL加pH 7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至50 mL，混匀，作为1∶20供试液。

2.2 阳性对照菌液的制备

将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种于营养肉汤培养基中，30～35℃培养18 h，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每1 mL中含菌数为50～100 cfu的菌悬液，备用；接种白色念珠菌的新鲜培养物于改良马丁琼脂培养基中，25℃培养24 h，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每1 mL中含菌数为50～100 cfu的菌悬液，备用；接种黑曲霉的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上，25℃培养5 d，加入5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每1 mL含孢子数50～100 cfu的孢子悬液，备用。

2.3 检查方法验证[4]

2.3.1 试验组

2.3.1.1 常规法 分别取1∶10供试液1 mL和试验菌株的菌悬液1 mL（50～100 cfu）入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，观察并计数。

2.3.1.2 培养基稀释法1 分别取1∶10供试液0.2、0.1 mL（0.2、0.1 mL/皿）和试验菌株的菌悬液1 mL（50～100 cfu）入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，观察并计数。

2.3.1.3 培养基稀释法2 分别取1∶20供试液0.1 mL（0.1 mL/皿）和试验菌株的菌悬液1 mL（50～100 cfu）入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，观察并计数。

2.3.2 菌液组

分别取1 mL试验菌株（50～100 cfu）入平皿中，立即倾注琼脂培养基混匀，待凝固后，置规定温度培养，观察并计数，每种菌各制备2个皿。

2.3.3 供试液本底测定

2.3.3.1 常规法 分别取1∶10供试液1 mL入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，观察并计数。

2.3.3.2 培养基稀释法1 分别取1∶10供试液0.2、0.1 mL入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，观察并计数。

2.3.3.3 培养基稀释法2 分别取1∶20供试液0.1 mL入平皿中，立即倾注琼脂培养基，待凝固后，置规定温度培养，观察并计数。

2.4 回收率测定

2.4.1 常规法测定

常规法测定回收率，白色念珠菌、黑曲霉菌、大肠埃希菌回收率均高于70%，可采用常规法进行霉菌、酵母菌计数；金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率低于70%，说明本品对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑菌作用，细菌检查不能采用常规法。见表1。

2.4.2 培养基稀释法测定

2.4.2.1 培养基稀释法（1∶10供试液，0.2 mL/皿）测定回收率 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌回收率高于70%，枯草芽孢杆菌回收率低于70%；采用培养基稀释法（1∶10供试液，0.2 mL/皿）不可消除本品对枯草芽孢杆菌的抑菌作用。见表1。

2.4.2.2 培养基稀释法（1∶10供试液，0.1 mL/皿）测定回收率 枯草芽孢杆菌回收率低于70%；采用培养基稀释法（用1∶10供试液，0.1 mL/皿）不可消除本品对枯草芽孢杆菌的抑菌作用。

2.4.2.3 培养基稀释法（1∶20供试液，0.1 mL/皿）测定回收率 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3次独立试验回收率均高于70%；采用培养基稀释法（1∶20供试液，0.1 mL/皿）可消除本品对枯草芽孢杆菌的抑菌作用。见表1。

2.5 控制菌检查法验证[5-6]

2.5.1 大肠埃希菌检查法

分别取1∶10供试液10 mL，加入3瓶100 mL胆盐乳糖培养基中，其中一瓶加入1 mL大肠埃希菌菌液（50～100个/mL）作为试验组，一瓶加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液（50～100个/mL）作为阴性菌对照组；另取1瓶100 mL胆盐乳糖培养基，加入1 mL大肠埃希菌菌液（50～100个/mL）作为大肠埃希菌阳性对照组。按大肠埃希菌检查法检验，结果见表2。

由表2可知，阴性菌对照组未检出大肠埃希菌，试验组检出大肠埃希菌。可采用常规法进行本品的大肠埃希菌检查。2.5.2 金黄色葡萄球菌检查法

分别取1∶10供试液10 mL，加入3瓶100 mL营养肉汤培养基中，其中一瓶加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液（50～100个/mL）作为试验组，一瓶加入1 mL大肠埃希菌菌液（50～100个/mL）作为阴性菌对照组；另取100 mL营养肉汤培养基，加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液（50～100个/mL）作为金黄色葡萄球菌阳性对照组。按金黄色葡萄球菌检查法检验，结果见表3。

表3 金黄色葡萄球菌检查结果

由表3可知，阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌，试验组检出金黄色葡萄球菌。可采用常规法进行本品的金黄色葡萄球菌检查。

2.5.3 铜绿假单胞菌检查法

分别取1∶10供试液10 mL，加入3瓶100 mL胆盐乳糖培养基中，其中一瓶加入1 mL铜绿假单胞菌菌液（50～100个/mL）作为试验组，一瓶加入1 mL大肠埃希菌菌液（50～100个/mL）作为阴性菌对照组；另取一瓶100 mL胆盐乳糖培养基，加入1 mL铜绿假单胞菌菌液（50～100个/mL）作为铜绿假单胞菌阳性对照组。按铜绿假单胞菌检查法检验，结果见表4。

由表4可知，阴性菌对照组未检出铜绿假单胞菌，试验组检出铜绿假单胞菌。可采用常规法进行本品的铜绿假单胞菌检查。

2.5.4 大肠菌群检查法

分别取110供试液1 mL，加入3管10 mL胆盐乳糖发酵管中，其中一管加入1 mL大肠埃希菌菌液（50～100个/mL）作为试验组，一管加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液（50～100个/mL）作为阴性菌对照组；另取1管10 mL胆盐乳糖发酵管，加入1 mL大肠埃希菌菌液（50～100个/mL）作为大肠菌群阳性对照组。按大肠菌群检查法检验，结果见表5。

表5 大肠菌群检查结果

由表5可知，阴性菌对照组未检出大肠菌群，试验组检出大肠菌群。可采用常规法进行本品的大肠菌群检查。

2.5.5 沙门菌检查法

分别取本品10 g，加入3瓶200 mL营养肉汤中，其中一瓶加入1 mL沙门菌菌液（50～100个/mL）作为试验组，一瓶加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液（50～100个/mL）作为阴性菌对照组；另取1瓶200 mL营养肉汤，加入1 mL沙门菌菌液（50～100个/mL）作为沙门菌阳性对照组，按沙门菌检查法检查。结果提示，阴性菌对照组未检出沙门菌，试验组未检出沙门菌，但沙门菌阳性对照组检出沙门菌，故不能采用常规法进行本品的沙门菌检查。所以沙门菌检查法调整为：分别取本品10 g，加入3瓶400 mL营养肉汤中，其中一瓶加入1 mL沙门菌菌液（50～100个/mL）作为试验组，一瓶加入1 mL金黄色葡萄球菌菌液（50～100个/mL）作为阴性菌对照组；另取1瓶400 mL营养肉汤，加入1 mL沙门菌菌液（50～100个/mL）作为沙门菌阳性对照组。按沙门菌检查法检验，结果见表6。

表6 沙门菌检查结果

由表6可知，阴性对照组未检出沙门菌，试验组检出沙门菌。可采用培养基稀释法进行本品的沙门菌检查。

3 讨论

本品按《中国药典》2010年版一部（附录ⅩⅢC）微生物限度检查法进行方法验证，结果表明，用pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制备样品，可采用培养基稀释法（1∶20供试液，0.1 mL/皿）进行细菌计数；采用培养基稀释法（400 mL营养肉汤）进行沙门菌检查；采用1∶10供试液的常规法进行霉菌及酵母菌计数和其他控制菌检查。笔者曾采用薄膜过滤法进行试验，但因供试品无法滤过，故选用培养基稀释法。

[参考文献]

[1] 国家药典委会.国家药品标准《新药转正标准》[M].11册.中国医药科技出版社，2011：43.

[2] 徐愚聪，王野.熊胆粉的研究进展[J].华西药学杂志，2000，15（3）：200-202.

[3] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：附录79.

[4] 颜栋林，李萍，兰茜.柴微生物限度检查法方法验证[J].中国当代医药，2009，16（16）：7.

[5] 权明吉，金仁顺，朴龙，等.熊胆粉对二甲基亚硝胺诱发大鼠肝纤维化的抑制作用[J].世界华人消化杂志，2005，13（20）：88.

[6] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：化学工业出版社，2005：附录71.

（收稿日期：2011-10-11 本文编辑：卫 轲）