两种新型多烯大环内酯抗生素对四种水稻病原真菌的抗菌活性和毒力测定

摘要：离体条件下，采用菌丝生长速率法和菌丝干重法测定新型多烯大环内酯抗生素――抗真菌霉素７０２和制霉色基素对水稻纹枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、水稻菌核病菌（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｉｇｍｏｉｄｅｕｍ Ｃａｖ．）、稻瘟病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、稻曲病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ ｖｉｒｅｎｓ）４种水稻病原真菌的抗菌活性和毒力。结果表明，抗真菌霉素７０２和制霉色基素对４种水稻病原真菌具有较强的抗菌活性，５０ μｇ／ｍＬ抗真菌霉素７０２对水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌的抑菌率分别为１００．００％、１００．００％、９１．７２％和６８．０６％， ＥＣ５０分别为７．００、１０．３０、１４．４１、２６．７１ μｇ／ｍＬ， ＥＣ９０分别为１３．２０、１７．６６、２７．６７、１２８．２８ μｇ／ｍＬ。１３ μｇ／ｍＬ制霉色基素对水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌的抑菌率分别为７８．２０％、１００．００％、１００．００％和７９．１７％， ＥＣ５０分别为１．４７、１．９１、２．３７、０．２０ μｇ／ｍＬ，ＥＣ９０分别为４１．０５、３．９２、４．３４、１３５．５４ μｇ／ｍＬ。总体上，制霉色基素对４种水稻病原真菌的抑菌活性强于抗真菌霉素７０２。

关键词：链霉菌７０２；抗真菌霉素７０２；制霉色基素；抗菌活性；水稻病原真菌

中图分类号：Ｓ４５１．２１ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）06－1123-05

Studies on Antifungal Activity and Toxicity of New type Polyene Antibiotics on Four Kinds of Rice Pathogenic Fungi

ＬＵ Ｈｕｉ，ＷＥＩ Ｓａｉ－ｊｉｎ，ＴＵ Ｘｉａｏ－ｒｏｎｇ，ＸＵ Ｊｉａ，ＴＵ Ｇｕｏ－ｑｕａｎ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｊｉａｎｇｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ，３３００４５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎｅｗ ｔｙｐｅ ｐｏｌｙｅｎｅ ｍａｃｒｏｌｉｄｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ-Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｍｙｃｉｎ ７０２ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ ｏｎ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ， Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｉｇｍｏｉｄｅｕｍ Ｃａｖ．， Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ａｎｄ Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ ｖｉｒｅｎｓ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｍｙｃｅｌｉａ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｈｙｐｈａ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ vitro． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｂｏｔｈ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｍｙｃｉｎ ７０２ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ ｈａｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｒｉｃｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ． Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ５０μｇ／ｍＬ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｍｙｃｉｎ ７０２， ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅｓ ｏｎ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ， Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｉｇｍｏｉｄｅｕｍ Ｃａｖ．， Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ ａｎｄ Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ ｖｉｒｅｎｓ ｗｅｒｅ １００．００％， １００．００％， ９１．72％ ａｎｄ ６８．06％， ａｎｄ ｔｈｅ ＥＣ５０ （μｇ／ｍＬ） ａｎｄ ＥＣ９０ （μｇ／ｍＬ） ｗｅｒｅ ７．００， １０．３０， １４．４１， ２６．７１ ａｎｄ １３．２０， １７．６６， ２７．６７， １２８．２８ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ １３μｇ／ｍＬ Ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ， ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｒｉｃｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ ｗｅｒｅ ７８．２０％，１００．００％，１００．００％ ａｎｄ ７９．１７％， ａｎｄ ｔｈｅ ＥＣ５０ （μｇ／ｍＬ） ａｎｄ ＥＣ９０（μｇ／ｍＬ） ｗｅｒｅ １．４７， １．９１， ２．３７， ０．２０ ａｎｄ ４１．０５， ３．９２， ４．３４， １３５．５４ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｍｙｃｉｎ ７０２．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ７０２； Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｍｙｃｉｎ ７０２； Ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ； ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ｒｉｃｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｇｉ

江西农业大学生物科学与工程学院南昌市发酵应用重点实验室在进行以棉花枯萎病为靶标的农用抗生素产生菌的分离筛选研究中，从棉田土壤中分离筛选到一株链霉菌，编号７０２。该菌所产抗菌活性物质在微量浓度下对细菌、霉菌和酵母菌均有极强的抑制作用［１］。从链霉菌７０２的发酵液中提取到抗细菌单体活性组分Ｓ２和抗真菌活性单体组分ＤＺＰ－８及ＤＺＰ－９，分别进行了鉴定。抗细菌单体活性组分Ｓ２在中国科学院上海有机化合物研究所协助下鉴定为９种氨基酸组成的环肽，分子质量

１ ２６９ u，分子式Ｃ６２Ｈ８４Ｎ１２Ｏ１７，为国内首次发现和鉴定，命名红谷霉素［２］。抗真菌活性单体组分在中国科学院昆明植物研究所协助下进行鉴定，抗真菌活性单体组分ＤＺＰ－９和ＤＺＰ－８均为多烯大环内酯抗生素。ＤＺＰ－９分子质量和分子式分别为６７０ u和Ｃ３５Ｈ５８Ｏ１２，ＤＺＰ－８的分子质量和分子式分别为为７０４ u和Ｃ３５Ｈ６０Ｏ１４。通过ＣＡＳ检索结构式发现ＤＺＰ－９与已知的制霉色基素（Ｆｕｎｇｉｃｈｒｏｍｉｎ）同质［３－５］，ＤＺＰ－８未见报道，是一种新型多烯大环内酯类抗生素，命名为抗真菌霉素７０２（Ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｍｙｃｉｎ ７０２）。多烯类抗生素是一类目前临床常用药中最不容易产生抗药性的抗真菌抗生素［６，７］，开发高效低毒的多烯类抗真菌抗生素是抗真菌药物研发的有效途径之一。

本试验研究抗真菌霉素７０２和制霉色基素对水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌４种水稻病原真菌的抗菌活性和毒力。

１ 材料与方法

１．１ 试验材料

１．１．１ 抗真菌活性物质 抗真菌活性物质ＤＺＰ－８，即抗真菌霉素７０２ （纯度９９．４６％）；ＤＺＰ－９，即制霉色基素（纯度９９．５７％），均由江西农业大学生物科学与工程学院应用微生物实验室提供，用甲醇溶解配成１ ０００ ｍｇ／Ｌ和１３０ ｍｇ／Ｌ溶液。

１．１．２ 供试菌 水稻纹枯病菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、水稻菌核病菌（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｉｇｍｏｉｄｅｕｍ Ｃａｖ．）、稻瘟病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ ｇｒｉｓｅａ）、稻曲病菌（Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ ｖｉｒｅｎｓ）菌株由江西农业大学教学实训基地提供。

１．１．３ 培养基 供试菌斜面、平板培养基均采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ＰＤＡ）；液体培养基采用ＰＤ培养基。

１．２ 试验方法

１．２．１ 抗真菌霉素７０２和制霉色基素对３种水稻病原真菌的毒力鉴定 将水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌菌株接种至ＰＤＡ平板上，水稻纹枯病菌和水稻菌核病菌于３０ ℃培养２ ｄ，稻瘟病菌于２７ ℃培养４ ｄ，用内径８．８ ｍｍ打孔器打取菌落边缘菌丝作为接种物。

采用菌丝生长速率法［８］进行毒力鉴定。将抗真菌霉素７０２和制霉色基素药液分别稀释１、２、４、８、１６倍，吸取１ ｍＬ不同浓度的药液与９ ｍＬ冷却至５０ ℃的ＰＤＡ培养基充分混匀制成系列浓度的含药平板，以添加等量无菌水的平板为空白对照（ＣＫ）。用打孔器打取水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌菌饼，将菌饼移至各含药平板中央，适温培养，同一处理重复３次。对照平板上菌落布满培养皿２／３时，用游标卡尺十字交叉法测量并记录各菌落直径，菌丝净生长量为菌落直径与菌饼直径之差，菌丝生长抑制率（抑菌率）按以下公式计算：

抑菌率＝

■×100%。

计算抗真菌霉素７０２和制霉色基素对水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑菌率。利用ＤＰＳ统计软件采用剂量对数－抑菌率机率值法［９］计算ＥＣ５０、ＥＣ９０及毒力回归方程。

１．２．２ 抗真菌霉素７０２和制霉色基素对稻曲病菌的抑制作用和毒力鉴定 采用菌丝干重法［１０］。将稻曲病菌菌株接种于３０ ｍＬ ＰＤ液体培养基中，于２６ ℃ １６０ r／ｍｉｎ摇床培养，制备均一的出发菌株。将不同浓度的抗真菌霉素７０２和制霉色基素加入已灭菌的ＰＤ培养基中制备成不同含药量的培养基，再接入等量均一的稻曲病菌，置于２６ ℃ １６０ ｒ／ｍｉｎ摇床振荡培养６ ｄ。取２张定量滤纸在分析天平上称重，质量分别记为ａ１和ｂ１。取某一处理浓度培养下的供试菌培养物用ａ１过滤并收集滤液，沥干后将附有菌丝体的滤纸称重记为ａ２；取滤液用ｂ１过滤，沥干后将滤纸称重记为ｂ２，菌体质量＝（ａ２－ａ１）＋（ｂ２－ｂ１）。利用上述方法测出抗真菌霉素７０２和制霉色基素不同浓度作用下稻曲病菌的菌体质量。以不含抗真菌霉素７０２和制霉色基素的ＰＤ培养基为空白对照，计算２种药剂对稻曲病菌的抑菌率，同一处理重复３次。利用ＤＰＳ统计软件，采用剂量对数－抑菌率机率值法计算ＥＣ５０、ＥＣ９０及毒力回归方程。

２ 结果与分析

２．１ 抗真菌霉素７０２对水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑制作用和毒力

抗真菌霉素７０２对水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌具有较强的抑制作用。由试验结果（表１）可知，５０ μｇ／ｍＬ抗真菌霉素７０２对水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑菌率分别达到１００．００％、１００．００％和９１．７２％；ＥＣ５０和ＥＣ９０分别为７．００、１０．３０、１４．４１ μｇ／ｍＬ和１３．２０、１７．６６、２７．６７ μｇ／ｍＬ。比较各处理ＥＣ５０和ＥＣ９０值可知，抗真菌霉素７０２对水稻纹枯病菌的ＥＣ５０和ＥＣ９０最低，抑菌活性最强。

２．２ 制霉色基素对水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑制作用和毒力

由制霉色基素对水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌的抑制作用和毒力测定结果（表２）可见，１３ μｇ／ｍＬ制霉色基素对水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌和稻瘟病菌的抑菌率分别为７８．２０％、１００．００％和１００．００％；ＥＣ５０和ＥＣ９０分别为１．４７、１．９１、２．３７ μｇ／ｍＬ 和４１．０５、３．９２、４．３４ μｇ／ｍＬ。综合比较各处理的ＥＣ５０和ＥＣ９０值可知，制霉色基素对这３种病原菌的抑菌活性由强到弱依次为水稻菌核病菌、稻瘟病菌、水稻纹枯病菌。

２．３ 抗真菌霉素７０２和制霉色基素对稻曲病菌抑制作用和毒力

采用菌丝干重法测定抗真菌霉素７０２和制霉色基素对稻曲病菌的抑制作用和毒力，测定结果见表３。从表３可见，抗真菌霉素７０２和制霉色基素对稻曲病菌均有一定抑制效果，５０ μｇ／ｍＬ抗真菌霉素７０２对稻曲病菌的抑菌率为６８．０６％，而１３ μｇ／ｍＬ制霉色基素对稻曲病菌的抑菌率可达７９．１７％，其ＥＣ５０分别为２６．７１、０．２０ μｇ／ｍＬ，ＥＣ９０分别为１２８．２８、１３５．５４ μｇ／ｍＬ。

３ 小结与讨论

３．１ 抗真菌霉素７０２和制霉色基素对水稻４种病原真菌的抑菌活性和毒力比较

抗真菌霉素７０２和制霉色基素是链霉菌７０２菌株所产的２种抗真菌单体组分，对水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌均有较强的抑制作用，且对不同病原菌的抑制作用差异较大。抗真菌霉素７０２对水稻纹枯病菌的抑菌活性最强，其次为水稻菌核病菌、稻瘟病菌、稻曲病菌。制霉色基素对水稻菌核病菌抑菌活性最强，其次为稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、稻曲病菌。抗真菌霉素７０２在５０ μｇ／ｍＬ时对水稻纹枯病菌、水稻菌核病菌、稻瘟病菌和稻曲病菌的抑菌率分别为１００．００％、１００．００％、９１．72％和６８．０６％，而制霉色基素在浓度仅为１３ μｇ／ｍＬ时对这４种病原菌的抑菌率则分别达到７８．２０％、１００．００％ 、１００．００％和７９．１７％，抑制作用明显强于抗真菌霉素７０２。毒力测定结果显示，抗真菌霉素７０２对４种水稻病原菌的ＥＣ５０为７．００～２６．７１ μｇ／ｍＬ，ＥＣ９０为１３．２０～１２８．２８ μｇ／ｍＬ；制霉色基素对４种水稻病原菌的ＥＣ５０为０．２０～２．３７ μｇ／ｍＬ，ＥＣ９０为３．９２～１３５．５４ μｇ／ｍＬ，综合比较可知，制霉色基素对这４种水稻病原菌的毒力强于抗真菌霉素７０２。

３．２ 抗真菌霉素７０２和制霉色基素的分子式相似但抑菌活性差异较大的原因分析

抗真菌霉素７０２和制霉色基素的分子式非常相似，抗真菌霉素７０２的分子质量比制霉色基素多３４ u，相当于多２个ＯＨ基，但试验结果显示二者抑菌活性差异较大。分析原因，可能是因为其化学立体结构不相同，两组分的化学立体结构差异有待于进一步通过Ｘ衍射试验来确定，从而从化学立体结构上的差异来解释2组分抑菌活性不同的原因。如青霉素的化学结构中不仅β－内酰胺键的化学活性影响其抑菌活性，分子母核的其他结构特征也起着重要作用［１１］。

抗真菌霉素７０２和制霉色基素均为新型多烯大环内酯抗生素，对于多烯类抗生素的抑菌活性机理，还未有精确阐释的文献报道。目前研究一般认为，多烯类抗生素抑菌机理主要体现在对病原菌细胞膜结构功能的破坏上［１２，１３］，如纳他霉素（Ｎａｔａｍｙｃｉｎ）主要作用于真菌细胞质膜，与质膜中含有的麦角甾醇作用损伤细胞质膜，造成细胞内物质泄漏，从而起到抑菌作用［１４，１５］。抗真菌霉素７０２和制霉色基素对水稻病原真菌的抑菌作用机理是否与纳他霉素相似、是否还存在其他作用机制导致二者抑菌效果的较大差异，还有待于进一步研究。

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