化学改性甘蔗渣对固定化细胞发酵产丁醇的影响

【摘 要】本文首先对于甘蔗渣表面采用聚乙烯亚胺进行化学改进，提高其丙酮丁醇梭菌XY16附载能力，而后将改性后的添加量10g/L甘蔗渣应用到应用到固定化批次发酵中，总溶剂浓度和丁醇经过36小时的发酵后，浓度达到最高点分别为：22.12g/L、12.34 g/L，此外，溶剂的生产速率是未改进甘蔗渣固定化细胞分批发酵速率的1.67倍，在此基础上，为保证稳定总溶剂与丁醇的产量，在连续重复六次对改性甘蔗渣固定化的细胞进行发酵，最终保证溶剂生产速率达到0.83 g/(L・h)，转化率也相应提高到0.42 g/g。

【关键词】 化学改性甘蔗渣；固定化细胞；丁醇

一、前言

作为一种新型液体燃料和化工原料，丁醇因为其良好的性能得到了广泛的重视。生物丁醇的制作方法明显异于化学方法，生物丁醇的发酵产生主要通过梭菌厌氧发酵，这种生产方法对于缓解环境污染以及能源短缺方面有着积极的作用。然而生物丁醇的生产制作也存在着明显的不足，生产速率低、发酵周期长、转化率低以及产物浓度低问题严重影响了生物丁醇的推广，目前，固定化细胞发酵技术在解决上述问题上有着明显的效果。

二、实验简介

为了有效的提高细胞在甘蔗渣上的固定效率，本文在对甘蔗渣进行化学改进时主要采用聚乙烯亚胺的方法进行，而后对于丙酮丁醇梭菌XY16在甘蔗渣上的固定效率以及分批发酵产丁醇性能的影响进行跟踪观察，而后在连续重复六次对改性甘蔗渣固定化的细胞进行发酵的过程中，仔细考察发酵过程中固定化纤维床的稳定性。

三、实验方法

（一）化学改进甘蔗渣方法

首先用粉碎机将甘蔗渣粉碎成5L*10L左右的小块状，将甘蔗渣的添加剂保持在10g/L，而后将甘蔗渣洗净并且烘干，然后将甘蔗渣浸泡于不同浓度的聚乙烯亚胺溶液两个小时，再进行洗净、烘干工作，最后将甘蔗渣浸泡于含有1g/L的戊二醛的磷酸盐缓冲液，清洗、烘干备用。

（二）固定化细胞发酵

固定化细胞单批发酵：按照10g/L的标准将化学改进后的甘蔗渣置放到30厘米柱长，内径3厘米的的层析柱中，这便构成了一个简单的固定化纤维床反应器。按照10%(V/V)的比率将培养了12小时的种子接种到自制五口烧瓶发酵装置（容量为2L, 装液量 1.5 L）,而后接通氮气10分钟，再经过8个小时的37℃厌氧培养后方可打开蠕动泵，确保实现发酵液在用氮气除氧的改性甘蔗渣固定化纤维床中循环，从而达到细胞固定化。

（三）固定化细胞连续发酵

固定化细胞的连续发酵中细胞固定化的方法与上一个步骤相同，值得注意的是当葡萄糖浓度在发酵过程中降低到20g/L，要用P2培养基去代替发酵液，而后接通氮气10分钟，然后反复进行批次发酵。

（四）检测方法

通过菌体生物量测定发酵液在600纳米波长下的吸光度，葡萄糖在检测时要采用SBA-40C型生物传感分析仪，使用智达N2000气相色谱仪进行发酵物的测定，测定时要以异丁醇作内标物。

四、结果与分析

（一）表面改性剂对甘蔗渣固定化效率及丁醇发酵的影响

添加量为1010 g/L的甘蔗渣，将聚乙烯亚胺改性试剂的浓度逐渐的提高到4 g/L，葡萄糖在36小时的发酵中完全消耗，总溶剂以及丁醇的浓度达到最高点分别为：22.12g/L、12.34 g/L，与为改进甘蔗渣的固定化细胞分批发酵相比，总容剂与丁醇浓度分别提高了28%、12%。而游离细胞的吸光度则大幅下降，由6.32下降到了0.49，大大提高了固定化效率。甘蔗渣固定化效率经过聚乙烯亚胺改性相比未改性甘蔗渣固定化效率的2.8倍，总溶剂的浓度伴随着聚乙烯亚胺的浓度大于6 g/L时出现下降趋势。由于细胞生长受戊二醛的抑制比较严重，如果戊二醛的添加量在实验过程中保持1 g/L时，溶剂生产速率与耗糖速率在固定化材料表面改性的刺激下有了大幅度的提高，相比为改进甘蔗渣的固化发酵，溶剂生产速率与耗糖速率分别为之前的1.48倍与1.67倍，这直接说明了化学改进后甘蔗渣的活力细胞的附载量大大提高。甘蔗渣的表面在化学改进前后有着明显的差异，化学改进前，甘蔗渣的表面比较平整且表面细胞吸附比较少，而改进后的比较粗糙，且表面吸附了大量细胞，并且呈膜状附着在甘蔗渣表面。

（二）化学改性甘蔗渣在重复批次发酵中的稳定性考察

甘蔗渣固定化细胞的发酵周期在重复批次发酵的影响下能够有效缩短，而且细胞固话的转化率和生产速率有着明显的提升，为看观测化学改进后蔗渣固定化效果的稳定情况，对化学改性甘蔗渣固定化的丙酮丁醇梭菌 XY16 进行重复批次发酵时，要充分利用含有60 g/L葡萄糖的 P2 发酵培养基，在6次重复批次发酵后，相关的数据结构表明，细胞在甘蔗渣表明的吸附能力比较平稳，而且丁醇的浓度比较稳定维持在10 g/L左右，总溶剂的浓度保持在能够维持在15-16g/L。转化率也相应提高到0.42 g/g，溶剂生产速率达到0.83 g/(L・h)，相比未改进的甘蔗渣固化发酵，分别有了32%、128%的提高，其效果非常明显。

五、结语

经过试验证明，化学改性甘蔗渣对固定化细胞发酵丁醇的稳定，作为固定化载体进行重复批次发酵，重复批次发酵过程中转化率的提高可能与高活力细胞的循环使用以及丙酮丁醇梭菌具有较低的木质纤维素降解能力有关。由此可见，化学改性甘蔗渣能够增强对细胞的吸附效率和提高菌体产溶剂性能，作为固定化载体能够使固定化细胞发酵长期高效的稳定运行。固定化细胞发酵技术在生物生物丁醇的制作中有着良好的可行性。

参考文献：

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