时间：2022-10-20 02:32:01
[摘要] 目的：完善银黄注射液的质量标准。方法：采用高效液相色谱法同时测定绿原酸和黄芩苷的含量，色谱柱为Agilent-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（30∶60）；检测波长：绿原酸为327 nm,黄芩苷为276 nm；流速1.0 ml/min;进样量20 μl；柱温30℃。结果：绿原酸在0.010 83～0.108 30 mg/ml范围内线性关系良好（r=0.999 44），平均回收率为100.24%，RSD为1.54%；黄芩苷在0.015 15～0.151 50 mg/ml范围内线性关系良好（r=0.999 99），平均回收率为100.48%，RSD为0.79%。结论：本方法简便、快捷、结果准确，可用于银黄注射液的质量控制。
[关键词] 银黄注射液；高效液相色谱法；质量标准；绿原酸；黄芩苷
[中图分类号]R927 [文献标识码]B [文章编号]1673-7210（2009）02（b）-031-03
Improvement on quality standard for Yinhuang Injection
GE Yu-song1, YANG Jin-jing2, ZHOU Hui-qin1
(1.Jiangsu Province Yancheng Institute for Drug Control,Yancheng 224002,China;2.College of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Traditional Medicine Institute,Nanjing 210046,China)
[Abstract] Objective: To improve the quality standard of Yinhuang Injection. Methods:HPLC was adopted for the determination of the chlorogenic acid and baicalin at the same time. Agilent-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm) was used,the mobile phase was composedofmethanol-0.4% phosphoric acid(30∶60)with the flow rate of 1.0 ml/min,the detective wavelength was set at 327 nm for chlorogenic acid and 276 nm for baicalin,the column temperature was maintained at 30℃. Results: The linear range of chlorogenic acid was 0.010 83-0.108 30 mg/ml(r=0.999 44),the average recovery was 100.24% with RSD of 1.54%. The linear range of baicalin was 0.015 15-0.151 50 mg/ml(r=0.999 99),the average recovery was 100.48% with RSD of 0.97%. Conclusion: The method is simple,accurate,and can be used for the quality control of Yinhuang Injection.
[Key words] Yinhuang Injection; HPLC; Quality standard; Chlorogenic acid; Baicalin
银黄注射液具有清热、解毒、利咽的功效，用于风热犯肺而致发热、咳嗽、咽痛等症；上呼吸道感染、急性扁桃体炎、咽炎见上述症候者皆可用之。处方中金银花和黄芩为重要药材，其中绿原酸和黄芩苷的含量与药品质量密切相关。《卫生部药品标准》中药成方制剂第十九册[1]采用紫外分光光度法测定其含量。本文采用HPLC双波长法同时测定其中绿原酸和黄芩苷的含量，分析速度快、分离效率高、检测灵敏度高、重复性好、结果可靠，可作为本产品质量控制的方法。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Aglient1200高效液相色谱仪,包括四元泵、柱温箱、紫外检测器、自动进样器、真空脱气机(美国惠普)；BP211D型电子天平，BT224S电子天平（德国Sartorius）；Cary100紫外分光光度计（美国Varian）。
1.2 试药
银黄注射液（四川升河制药有限公司，批号050655、060505、061203）；对照品：绿原酸（批号110753-200413）、黄芩苷（批号0821-200104），均购自中国药品生物制品检验所；甲醇为色谱纯；试验用水为纯净水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为Agilent-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（30∶60），检测波长为327 nm（绿原酸），然后切换至276 nm（黄芩苷）处，流量1.0 ml/min，进样量20 μl，柱温30℃。理论板数按绿原酸计算应不低于1 500，分离度应不小于1.5。在此色谱条件下进样，所得结果见图1、2。
2.2 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备精密称取黄芩苷对照品15.15 mg和绿原酸对照品10.83 mg，置50 ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，制成对照品储备液。
2.2.2 供试品溶液的制备取供试品2 ml置100 ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，取2 ml置25 ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，制成供试品溶液。
2.3 标准曲线的制备
分别吸取对照品储备液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml置10 ml容量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，制得标准溶液系列，取20 μl进样，测定。以对照品浓度对峰面积平均值作图，经线性回归后黄芩苷在0.015 15～0.151 50 mg/ml范围内线性关系良好，回归方程为Y=42 297.626 7X－6.032 384，r=0.999 99；绿原酸在0.010 83～0.108 30 mg/ml范围内线性关系良好，回归方程为Y=36 895.908 6X－25.047 918，r=0.999 44。结果见图3、4。
2.4 精密度试验
取对照品储备液2 ml，置10 ml容量瓶中，加40%甲醇稀释至刻度，摇匀。精密量取20 μl，在上述色谱条件下连续测定6次，以峰面积计算RSD，结果绿原酸RSD为0.2%，黄芩苷RSD为0.2%，表明精密度良好。
2.5 重复性试验
取同一批样品（批号050655）6份，分别制成供试品溶液，按含量测定法测定，结果绿原酸平均含量为13.63 mg/支， RSD为0.1%；黄芩苷平均含量为20.26 mg/支，RSD为0.1%。
2.6 稳定性试验
精密吸取新配制的供试品溶液（批号050655）按含量测定法，分别于0、2、4、6、8、10、12 h取20 μl进样测定，结果绿原酸RSD为0.84%,黄芩苷RSD为0.67%，表明样品溶液在12 h内稳定。
2.7 加样回收率试验
精密吸取供试品溶液2 ml，置100 ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀；精密吸取2 ml置25 ml容量瓶中，平行试验9份，分为3组。每组分别精确加入对照品储备液2、3、4 ml，加50%甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取对照品储备液1 ml置10 ml容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
分别精密量取上述对照品溶液和供试品溶液各20 μl，注入色谱仪，记录色谱图，计算加样回收率，结果见表1、2。
表1 黄芩苷回收率试验结果
表2 绿原酸回收率试验结果
2.8 样品含量测定
取3个批号的注射液，照“2.2.2”供试品溶液制备项下法制备，精密吸取供试品溶液20 μl,按上述色谱条件测定，计算样品中绿原酸和黄芩苷的含量，结果见表3。
3 讨论
本品原含量测定法原标准采用双波长比值光谱法，该法要求样品中含有的成分比较单一，而银黄注射液为金银花提取物和黄芩提取物的混合物，从图2可以知道除绿原酸和黄芩苷外该注射液还含有其他杂质，它们可能与两种主成分的吸收光谱有所重迭。另外，紫外吸收法专属性差，以前曾有过紫外法检验含量合格，而当采用液相检验时含量不合格甚至不含有效成分的情况，因此现在标准多采用高效液相法。高效液相色谱法具有分离效率高、分析速度快、检测灵敏度高和应用范围广泛的特点[2]，特别适用于多组分药品的测定，目前在药品检验工作中使用非常广泛。文献[2～4]只能测定一种成分或分别测定两种成分；采用相同波长同时测定多种组分的含量[5]，因某些成分的最大吸收波长和测定波长不一致导致误差较大。笔者参考《中国药典》2005年版一部[6]尝试采用高效液相色谱法同时测定银黄注射液中绿原酸和黄芩苷的含量，因两组分的最大吸收峰不一样，保留时间相差较大，先用绿原酸的最大吸收波长测定其含量，待绿原酸出峰后，再用黄芩苷的最大吸收波长测定黄芩苷的含量，因而本实验采用的是不同波长测定多种组分含量的方法。实验证明本方法快速、方便、分离度好，适用于复方制剂中两种成分的同时测定。
检测波长的选择：分别取绿原酸和黄芩苷对照品的50%甲醇溶液，在200～400 nm波长范围内扫描，结果绿原酸在327 nm处有最大吸收，黄芩苷在276 nm处有最大吸收。经反复试验，选择先在327 nm处检测绿原酸，待绿原酸出峰后，切换至276 nm处检测黄芩苷，效果良好。
试验中曾用甲醇稀释对照品和样品，结果出现前拖尾现象，改用50%甲醇稀释取得满意效果。
[参考文献]
[1]中华人民共和国卫生部.卫生部药品标准[S].北京:人民卫生出版社,1998.197-198.
[2]陈国强,吴韶铭.HPLC法测定银黄口服液中绿原酸和黄芩苷的含量[J].中国现代应用药学,2001,18(4):62-63.
[3]孟品佳,孙敏庆.高效液相色谱法分离金银花成分及测定绿原酸含量[J].药物分析杂志，1990,10(1):58.
[4]潘馨.高效液相法测定银黄胶囊中绿原酸及黄芩苷的含量[J].中国现代应用药学,2003,20(6):493-495.
[5]王波,王健,董蓬.RP-HPLC测定复方感冒灵片中对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏的含量[J].中成药,2003,25(7):24-27.
[6]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：化学工业出版社,2005.612.
（收稿日期：2008-09-16）