时间：2022-10-20 10:39:20
[摘要] 目的 通过转录因子Smda5基因克隆以及真核表达载体的构建，为以后研究转录因子Smad5在牙釉质发育的分子调控方面奠定基础。方法 根据引物设计原则设计Smad5基因的PCR引物， 以从小鼠成釉细胞中提取的总RNA逆转录所得cDNA为模板，进行PCR扩增，用PCR法扩增得出含有KnpⅠ和XbaⅠ的Smad5目的基因连接到pcDNA3.1/myc-HisA真核表达载体上。结果 经过PCR引物扩增得到1419bp基因片段，将获得的重组质粒pcDNA3.1/myc-HisA-Smad5双酶切分析鉴定，测序结果与GenBank登录基因完全一致。结论 成功实现了Smad5基因克隆及表达载体的构建，为以后研究转录因子Smad5在牙釉质发育的分子调控方面奠定基础。
[关键词] 转录因子Smad5；基因克隆；载体构建
Smad5是参与转化生长因子-β信号下游的细胞质内信号转导分子Smad家族成员之一，在哺乳动物已经分离鉴定的Smad蛋白有8种，Smad蛋白最早是通过基因筛查在无脊椎动物中分离出来的，它主要作用于丝氨酸/苏氨酸激酶受体下游。Smad蛋白分子量为（40-60）kd，其一级结构分为3个功能区，高度保守的N区和C区，以及序列长度不一的中间连接区（L）。骨形成蛋白是属于转化生长因子（TGF―β） 超家族，是一种在细胞生长、分化、凋亡和机体多种组织和器官形态发生中起重要调控作用的细胞因子。BMPs在牙胚的发生、成牙本质细胞的分化、第3期牙本质的形成中均发挥重要的作用[1，2]。本实验室重点研究TGF―β在牙釉质发育过程中的作用，Smad5作为BMPs的特异细胞内信号转导分子[3，4]，值得我们去探讨。本研究通过基因克隆及基因重组技术构建了Smad5的真核表达载体，为进一步研究TGF-β/Smad5与牙釉质发育相关基因的调控，表达奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
小鼠成釉细胞系（ALC）， RT-PCR试剂盒， RNAiso Plus，为Takara公司产品。质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒为上海生工公司产品。真核表达载体pcDNA3.1/myc-hisA及E.coli BL21（DE3）由本实验室保存， DNA marker、KnpⅠ，XbaⅠ 和T4 DNA连接酶均为Promega公司产品。试验中所用引物合成与产物测序均在大连Takara公司完成。
1.2 实验方法
1.2.1小鼠成釉细胞的培养
本实验室所用的成釉细胞系为日本Akita大学Sugiyama教授馈赠，在DMEM培养基（含100 g/L FBS），37℃，50 mL/L CO2 条件下进行培养。
1.2.2小鼠Smad5的克隆
1.2.2.1小鼠成釉细胞总RNA的提取以及cDNA的合成
小鼠成釉细胞系（ALC）复苏后，细胞传至3代以上用于实验。当细胞长满瓶底约80%-90%时，使用RNAiso Plus试剂按照说明书提取小鼠成釉细胞总RNA。参考反转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 的要求进行反转录，在20μl体系中加入5μl的总RNA，1μl oligo（dt）18primer，6μl RNase-Free水，70℃温育10min后立即冰上冷却，在加入1μl Rnase Inhibitor，2μl dNTPmixture，4μl 5*Reaction Buffer ，混合均匀后37℃保温5min ，再加入1μl M-MuLV Reveerse Transcriptase，42℃温育60min 。70℃10min灭活逆转录酶，冰上冷却。获得用以进行RT-PCR的cDNA模板。
1.2.2.2 Smad5引物设计，合成以及PCR扩增
根据引物设计原则，利用软件Primer primer 5.0和Oligo 6进行引物设计。上游引物P1为：5′-TATA-GGTACC-ATGACGTCAATGGCCAG -3′，含KnpⅠ的酶切位点；下游引物P2为：5′- GCCCG-TCTAGA-TTATGAAACAGAAGATATGG -3′，含XbaⅠ的酶切位点。扩增条件94℃ 4 min，92℃ 30 s，62 ℃ 40s， 72℃ 3min，35个循环后72℃延伸5 min。
1.2.2.3 PCR产物琼脂糖凝胶电泳及其回收纯化
PCR反应结束后，取10μl反应液进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察并拍照。按照DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行PCR产物的割胶回收。
1.2.2.4目的片段与pMD18-T Simple Vector连接反应
将割胶回收纯化的Smad5目的基因片段与pMD18-T Simple Vector 连接，16℃连接过夜约16h-24h后，连接成功后将其命名为pMD18-T-Smad5，然后转化至感受态细胞DH5α中。
1.2.2.5重组质粒pMD18-T-Smad5的抽提及酶切鉴定
按照质粒抽提试剂盒说明书进行重组质粒的抽提，经DNA酶切信息软件分析，选取合适的酶进行酶切鉴定，。将用酶切进行初步鉴定后结果为阳性的克隆送至金斯瑞有限公司进行DNA测序。
1.2.4 真核表达载体的构建
用KnpⅠ和XbaⅠ分别双酶切pMD18-Smad5和pcDNA3.1/myc-HisA空载体，进行割胶回收，连接并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含氨苄的LB平板筛选并挑单菌落培养抽提质粒进行酶切鉴定，鉴定正确后送金斯瑞公司进行DNA测序，测序正确者命名为pcDNA3.1/myc-HisA-Smad5。
2 实验结果
2.1 Smad5基因的克隆
以Smad5 P1、P2为引物，小鼠成釉细胞总cDNA为模板扩增出约1419bp的片段，大小同与GenBank中报道的小鼠Smad5基因CDS区序列长度相符。（图1）
2.2表达载体的构建结果
构建的Smad5基因重组表达载体经KnpⅠ和XbaⅠ双酶切后得到量个片段分别为1419bp和5500bp，与预测结果一致（见图2）。
将初步鉴定正确的重组质粒pcDNA3.1/myc-hisA-Smad5送至金斯瑞公司进行测序。得到的测序结果进行BLAST分析，与GenBank中登录基因序列完全一致无点突变和移码突变（图3）
1. Smad5扩增后产物 2. Marker
1. Marker 2. 酶切产物
3讨论
迄今为止，至少有8个类似于Smad的基因在蟾蜍、小鼠及人类中发现，它们均是丝氨酸/苏氨酸受体下游信号转导途径中的成员。研究者将脊椎动物中的这些TGF-β信号转导基因命名为Smad。Smads编码42～60kd的蛋白质，在不同物种间高度保守。它们含有高度保守 的N 端功能域和C端功能域，又称为MH1和MH2功能域。两个功能域之间含有一个富含脯氨酸的连接区。研究显示，Smads的MH1和MH2 功能域相互作用并相互抑制。受体激活后， Smads分子打开并形成异源三聚体，转移到细胞核内激活下游靶基因的转录。在脊椎动物体内的TGF-β信号转导途径中，Smad家族占据了极为重要的作用。
Smad5是Smad蛋白家族中的成员，主要介导骨形态形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）的信号。BMP通过调节一群广泛多样的基因活性，控制着如中胚层形成、左右对称、神经系统发生、体节和骨骼发育等基本的发育过程[5，6]。研究表明Smad5基因剔除小鼠在胚胎11.5天前死于多种胚胎及胚外组织缺陷[7]。
目前对Smad5的研究多集中在胚胎发育，牙本质形成等方面，而针对牙釉质的报道较少。本实验通过Smad5基因的克隆和真核表达载体的构建获得了重组质粒pcDNA3.1/myc-hisA- Smad5，为细胞转染做预先准备，为进一步研究Smad5与牙釉质发育有关的基因启动子结合序列结合，及其调控奠定了基础，如小鼠MMP-20启动子区域含有多个Smad的结合序列，而MMP-20基因与牙齿，牙釉质的发育密切相关。
目前认为，MMP-20主要在成釉细胞的分泌期降解牙釉质蛋白，是一种牙齿特异表达的基质金属蛋白酶，与牙釉质发育有密切关系。MMP-20 的表达始于牙釉质分泌的早期阶段，是降解牙釉质基质蛋白主要蛋白酶。MMP-20 可水解釉基质蛋白，包括釉原蛋白（Amelogenin）和成釉蛋白（Ameloblastin）[8，9]，促进羟基磷灰石的沉积，利于釉质的矿化。因此Smad5与各种基因启动子作用机制进一步研究对于深切了解牙釉质的发生、发展具有重要理论意义，对于牙釉质疾病的预防具有潜在的指导意义。
参考文献：
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