水杨酸处理对结球白菜幼苗生理活性的影响

【摘要】本试验通过对5叶期结球白菜幼苗喷洒不同浓度的水杨酸，研究SA诱导对结球白菜幼苗相关生理活性的影响。

【关键词】水杨酸；结球白菜；几丁质酶；诱导。

【 abstract 】 this test on 5 leaf stage "ball cabbage seedlings spray different concentration of salicylic acid, research on the ball induced SA cabbage seedlings physiological activity related to the effect.

【 keywords 】 salicylic acid; "The ball cabbage; Chitinase; Induction.

中图分类号：Q946.82+8.3文献标识码： A 文章编号：

水杨酸(又称邻羟基苯甲酸，salicylic acid，SA)是一种广泛存在于植物体内的小分子酚类物质,它与植物的开花、气孔的关闭、种子的萌发、光合、呼吸、蒸腾、膜的通透性等许多生理过程有关。大量的研究结果表明，它与植物的抗病性有关，是植物系统性诱导抗病性信号传递系统中的重要组成部分。本文就外源水杨酸对结球白菜生理活性的影响进行研究，为进一步研究水杨酸的作用机理提供理论依据。

.1、试验

本实验在室内采用营养钵播种育苗结球白菜，苗期进行正常管理。第5片真叶展平时，用喷雾器将浓度分别为1 mmol.L-1、2.5 mmol.L-1、5 mmol.L-1和7.5 mmol.L-1的水杨酸溶液和蒸馏水分别均匀喷于叶部，分别在处理后8 h、12 h、16 h、20 h提取粗酶液；同时用喷雾器将浓度分别为0.3 mmol.L-1、0.6mmol.L-1、0.9 mmol.L-1、1.2 mmol.L-1、1.5 mmol.L-1、1.8 mmol.L-1、2.0 mmol.L-1、2.5mmol.L-1的水杨酸溶液和蒸馏水分别均匀喷于第5片真叶展平时的叶部，在处理后12 h提取粗酶液。

（1）粗酶液的提取

首先是几丁质酶粗酶液的提取

水杨酸处理后，选取生长正常具有代表性的成熟叶片，洗净晾干，称取1克剪碎置研钵内，加入6ml的0.1 mmol.L-1柠檬酸钠缓冲液(pH5.0)，冰浴中，研磨,将溶液转移置7ml离心管，4℃冷冻离心(1000r/min，10min)，收集上清即得粗酶液。

其次是 SOD 、POD和CAT酶液的提取

第5片真叶展平时，用喷雾器将浓度分别为0.3 mmol.L-1、0.6mmol.L-1、0.9 mmol.L-1、1.2 mmol.L-1、1.5 mmol.L-1的水杨酸溶液和蒸馏水分别均匀喷于叶部，分别在处理后8 h、12 h、16 h、20 h提取粗酶液：称取 0.1g结球白菜幼苗叶片放入研钵中，取 5 mL1/15 mol 磷酸缓冲液( pH=7.8)倒入研钵内，冰研磨成匀浆，6000 r/min 离心20 min，倾出上清液，放入5 mL试管内，剩余物加少量缓冲液冲洗后，再次离心(6000r/min，5min)，取上清液，如此重复3次，直到酶粗提液补足 5 mL。将酶液放入4℃冰箱中保存备用。以上方法用于SOD 和CAT酶液的提取，而 POD 酶液的提取使用的是0.01mol/L磷酸缓冲液(pH=7.2)，其余方法同上。

（2） 酶活的测定

第一、几丁质酶活性的测定

几丁质酶活力的测定参照陈崇顺等的方法[19]，试验重复4次。胶体几丁质的制备参照Berger和Reynolds等方法[20]。取400μL胶体几丁质（10mg/ml），加1400μL（10 mmol.L-1）磷酸钠缓冲液（pH6.4）混匀，再加800μL粗酶液混匀，置37℃恒温水浴保温2h，然后置100℃煮沸3min，室温离心10min(2400r/min)。取上清液400μL，加20μL（1 mmol.L-1）磷酸钠缓冲液（pH7.1）和80μL的1%（W/V）蜗牛酶，将反应液置于37℃恒温水浴30min，以水解几丁质寡糖，最后按照Reissig等的比色法，测定所有N-乙酰氨基葡萄糖。以在上述条件下，每增加0.010光密度值的酶量为1个酶活力单位（U）。

第二、超氧化物歧化酶活性测定

SOD活性测定参照王爱国等【21】和韩雅珊【22】的方法。3mL反应液中含有：0.013 mol/L 甲硫氨酸、63×10-6 mol/L 氮蓝四唑、1.3×10-6 mol/L 核黄素、1×10-4mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)及 pH=7.8 的0.05mol/L 磷酸缓冲液，加入稀释30倍的酶粗提液1mL，在 30℃下用 4000 Lux 荧光照射10 min，并在 560 nm 波长下测量透光率。以每分钟每克鲜重 OD 值变化1.00所需的酶量为一个酶活单位（OD/gfw.min）。各样品均重复测定2次。

第三、过氧化物酶活性测定

采用愈创木酚做底物，用分光光度法测定生成物的含量。反应液中含有0.1mol/L磷酸缓冲液(pH=7.2) 1mL、0.1mol/L愈创木酚1mL、0.8%H2O21mL，并加入适量的酶液后在30℃下反应20min，并在470nm波长下测定吸光值。以1mL去离子水代替H2O2为对照。在上述反应条件下，以每分钟每克鲜重 OD 值变化1.00所需的酶量为一个酶活单位（OD/gfw.min）。各样品均重复测定2次。

第四、 过氧化氢酶活性的测定

取两份等量的酶提取液：一份煮沸3-5分钟，另一份保持活性，各加入2mL1%的H2O2保温（30℃）10分钟，用1%的H2SO4终止反应。用已标定浓度的高锰酸钾滴定余下的H2O2，至溶液显粉红色半分钟内不消失为止，可用mg H2O2g-1min-1为单位表示。

2、结果与分析

（1）不同浓度水杨酸诱导对几丁质酶活力的影响

实验利用不同浓度的水杨酸处理第5片真叶展平时的结球白菜植株，分别在处理后8 h、12 h、16 h、20 h提取粗酶液并测定酶活，观察到1.0 mmol.L-1水杨酸浓度诱导试验组效果最佳，处理后12 h左右几丁质酶的活力达到最高。

采用不同浓度的水杨酸对第5片真叶展平时的结球白菜植株处理12 h，提取粗酶液并测定酶活，结果发现0.6 mmol.L-1水杨酸浓度诱导试验组效果最佳，几丁质酶的活力达到10.5 U

（2）不同浓度水杨酸诱导对SOD酶活力的影响

实验利用浓度为0.3 mmol.L-1、0.6mmol.L-1、0.9 mmol.L-1和1.2 mmol.L-1的水杨酸分别处理结球白菜植株，分别在处理后8 h、12 h、16 h、20 h提取粗酶液并测定酶活，结果发现SA处理后的结球白菜的超氧化物歧化酶（SOD）的活性都有不同程度的提高，并且低浓度的SA有利于提高SOD的活性。由图3可以看出，0.6mmol/L水杨酸浓度诱导试验组效果最佳，处理后16 h左右SOD酶的活力达到最高。

（3）不同浓度水杨酸诱导对POD酶活力的影响

试验利用浓度为0.3 mmol.L-1、0.6mmol.L-1、0.9 mmol.L-1、1.2 mmol.L-1的水杨酸分别处理结球白菜植株，分别在处理后8 h、12 h、16 h、20 h提取粗酶液并测定酶活，由图4可以看出，SA处理后，结球白菜的过氧化物酶（POD）的活性都有不同程度的提高，并且随着SA浓度的增加，POD的活性逐渐提高，且1.2mmol/L水杨酸处理后20 h左右POD酶的活力达到最高。

（4）不同浓度水杨酸诱导对CAT酶活力的影响

试验利用浓度为0.3 mmol.L-1、0.6mmol.L-1、0.9 mmol.L-1、1.2 mmol.L-1的水杨酸分别处理结球白菜植株，分别在处理后8 h、12 h、16 h、20 h提取粗酶液并测定酶活，由图5可以看出， SA处理后结球白菜的过氧化氢酶（CAT）的活性都有不同程度的降低，而且CAT的活性随SA浓度的增加而逐渐降低。且0.3mmol/L水杨酸浓度处理8 h左右，CAT酶的活力达到最高

3、结论与讨论

试验表明，不同浓度水杨酸处理后，几丁质酶活性均在12h左右达到最大值，而在相同处理时间（12h）下，以0.6 mmol.L-1浓度的水杨酸诱导试验组几丁质酶的活力达到最高10.5U。SOD是清除Mehler反应产物超氧阴离子（O2-）的关键酶，它催化O2-发生歧化反应生成氧化性较弱的H2O2，H2O2又在CAT和POD酶的作用下形成H2O，减少活性氧对植株体的毒害作用。SA处理后结球白菜SOD的活性得到了提高，且低浓度的SA对提高SOD的活性作用更明显。基于POD 的生理作用,其活性既与组织受伤害的程度有关,也与组织减轻伤害的能力有关,因此SA处理后结球白菜的POD的活性也有不同程度的提高，并且高浓度的SA有利于提高POD的活性。SA处理后结球白菜的CAT的活性却有不同程度的降低，而且CAT的活性随SA浓度的增加而降低，这可能是CAT与SA结合，从而降低了CAT的活性。