去甲基化作用对胃癌细胞生物学行为及xaf1基因表达的影响

【摘要】 目的：探讨去甲基化药物5?脱氧杂氮胞苷(5?aza?cdr)对体外培养的胃癌bgc823细胞增殖活性、细胞周期和凋亡以及对此细胞株xaf1基因表达的 影响 . 方法 ：用mtt法检测不同浓度5?aza?cdr对细胞增殖活性的影响；pi染色和流式细胞仪检测不同浓度5?aza?cdr处理72 h后细胞周期分布和细胞凋亡率；rt?pcr法检测用药前后xaf1基因表达的变化. 结果：用1×103，5×103，10×103 nmol/l的5?aza?cdr处理bgc823细胞6 d后，试验组细胞增殖抑制率较对照组明显升高（p<0.05），并呈剂量依赖关系；流式细胞仪 分析 表明，各药物浓度处理72 h后凋亡率明显增加：试验组凋亡率分别为（4.53±0.21）%，（8.11±1.01）%和（11.56±0.86）%，与对照组(0.51±0.01)%相比较差异显著(p<0.05). 在5?aza?cdr处理前，未检测到bgc823细胞株xaf1 基因mrna表达，经过5?aza?cdr处理后，xaf1 mrna重新表达. 结论：5?aza?cdr可抑制bgc823细胞增殖；促进细胞凋亡；使xaf1基因甲基化状态得到逆转，而重新表达.

【关键词】 5?氮?2?脱氧胞苷；xaf1基因；bgc823肿瘤细胞株；甲基化；细胞增殖；细胞凋亡

【abstract】 aim: to observe the effects of the demethylating agent, 5?aza?2′?deoxyctidine (5?aza?cdr), on the proliferation, cell cycle, apoptosis and xaf1 mrna expression of stomach cancer bgc823 cells. methods: the proliferation of bgc823 cells treated by different concentrations of 5?aza?cdr was detected by mtt assay. assessment of cell cycle and apoptosis were performed by flow cytometry (fcm); the change of xaf1 mrna expression was semi?quantified by rt?pcr before and after 5?aza?cdr treatment. results: the growth inhibitory effects on bgc823 cells were observed in a dose?dependent manner after exposure to 5?aza?cdr at different concentrations (1×103, 5×103, 10×103 nmol/l) for different time. fcm analysis showed that the apoptosis rates in bgc823 cells ［(4.53±0.21)%, (8.11±1.01)%, (11.56±0.86)%］ increased significantly after exposure to 5?aza?cdr for 72 h as compared with the control group ［(0.51±0.01)%, p<0.05］. no expression of xaf1 gene in bgc823 cells was observed, but it was expressed after 5?aza?cdr treatment (5×103, 10×103 nmol/l). conclusion: 5?aza?cdr can inhibit the proliferation of bgc823 cells through blocking cell cycles and inducing cell apoptosis. it can also restore xaf1 gene transcription silenced by demethylation.

【keywords】 5?aza?cdr；xaf1；bgc823；methylation；proliferation；apoptosis

0 引言

凋亡抑制蛋白因子家族(iap)的成员在结构上具有1至3个高度保守的杆状病毒凋亡抑制因子重复序列(bir)结构域［1］，在肿瘤的增殖异常及对抗肿瘤药物耐受形成中发挥了重要作用. x染色体相关凋亡抑制蛋白(xiap)是iap中抑制caspase活性最强的成员. xiap相关因子1(xaf1)是一个新近发现可以拮抗xiap抗凋亡作用的蛋白，它可以逆转xiap对细胞的保护. xaf1在多种肿瘤细胞和组织中存在低表达或表达缺失，xaf1的基因沉默与其启动子高甲基化明显相关［2］. 我们采用5?aza?cdr对胃癌细胞株进行处理, 检测xaf1基因表达，并分析肿瘤细胞生物学行为变化，以期进一步探讨胃癌的发生机制及 治疗 的新方法.

1 材料和方法

1.1 材料 胃癌bgc823细胞株（兰州大学病理解剖学教研室）；rpmi?1640培养液（美国gibco公司）；胎牛血清（兰州民海生物技术有限公司）；5?aza?cdr（美国sigma公司）；配制5?aza?cdr为1 mol/l的母液，-20℃保存，使用时用rpmi?1640稀释为工作浓度. tap酶（上海生工生物工程技术有限公司）；酶联免疫检测仪(bio?tek公司)；trizol(invitrogen公司)；uv3000紫外分光光度仪（上海美谱达公司）；流式细胞仪(beckman coulter公司).

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞贴壁生长于rpmi?1640培养液中，内含100 ml/l胎牛血清、1×105/l青霉素、100 mg／l链霉素和2 mmol/l l?谷氨酰胺，置于37℃ 50 ml/l co2的饱和湿度箱中培养，每3～4 d消化传代1次. 传代时，常规消化bgc823细胞，置于75 mm培养瓶中，培养24 h后分别用含1×103，5×103，10×103 nmol/l 5?aza?cdr的完全培养液连续培养24，48和72 h后弃去药液，用完全培养液继续培养24 h后进行实验. 以同体积磷酸盐缓冲液pbs(ph 7.4)处理的细胞作为对照组. 培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态的变化.

1.2.2 mtt法绘制细胞生长曲线 取对数生长期细胞，常规消化后按每孔2×103个(100 μl)接种于6块96孔培养板中，过夜贴壁后弃完全培养液，分别加入含1×103，5×103，10×103 nmol/l 5?aza?cdr药液的完全培养液，每孔100 μl，每组设3个复孔；对照组加入等量pbs. 每日取出1板加入5 g/l mtt液10 μl，37℃孵育4 h后加dmso 150 μl，振荡器振荡10 min充分溶解结晶，在酶联免疫检测仪测定各孔a470 nm值，求其平均值，以a470 nm值为纵坐标，时间(d)为横坐标绘制生长曲线, 计算 细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，cpir). cpir(％)=(1-实验组a470 nm均值／对照组a470 nm均值)×100％.

1.2.3 rt?pcr检测xaf1基因mrna表达 取对数生长期bgc823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集细胞，trizol一步反向法抽提细胞总rna，在紫外分光光度仪上测定吸光度值，鉴定rna纯度，a260 nm／a280 nm在1.8～2.0之间. pcr引物设计及反应条件如下：xaf1：预期产物片段大小为120 bp，退火温度：56℃；sense：5′?tgggtgtaggattctccagg?3′，antisense：5′?ggtttgcccaaggactacaa?3′. 内参照gapdh:预期产物片段大小为456 bp，退火温度：52℃；sense：5′?ttctccccattccgtcttcc?3′，antisense：5′?gtacatggtattcaccaccc?3′，上述引物由大连宝生物有限公司提供合成. 两步法rt?pcr：① 逆转录反应：20 μl反应体系含：2 μg模板rna，0.5 g/l oligo(dt)18，rnase?free ddh2o，5×reaction buffer，2×107 u/l rnase inhibitor，10 mmol/l dntp mix，2×107 u/l a?mulv rt. 70℃ 5 min，37℃ 5 min，37℃ 60 min，70℃ 10 min，4℃保存. ② 聚合酶链反应：50 μl反应体系含：cdna 1 μl，10×buffer 5 μl，25 mmol/l mgcl2 3 μl，2.5 mmol/l dntp 5μl，tap酶0.5 μl，上下游引物各1 μl，去离子水补至50 μl，gapdh作内参照. pcr仪扩增条件：94℃变性4 min，按94℃ 30 s，52℃（或54℃）40 s，72℃ 45 s，进行35个循环，最后一个循环72℃延伸5 min. pcr产物经20 g/l琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统分析，以xaf1和gapdh吸光度比值相对定量.

1.2.4 细胞周期和凋亡率检测 取对数生长期bgc823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集培养细胞，pbs洗2次，调整细胞密度为1×109个／l，700 ml/l冷乙醇－20℃固定24 h，加rnasea至终浓度1 g/l，37℃温育30 min，加碘化丙啶至终浓度50 g／l，1 h内测定. 以流式细胞仪进行细胞周期分析和凋亡率的检测.

统计学处理:实验数据以x±s表示，采用spss 11.5软件进行分析，不同组间率的比较采用单因素方差分析.

2 结果

2.1 5?aza?cdr对细胞增殖的 影响 分别用1×103，5×103，10×103 nmol/l 5?aza?cdr处理6 d后，bgc823细胞的生长增殖活性均有明显抑制，3个试验组的cpir值分别为（22.36±0.68）%，（32.12±1.27）%和（41.34±1.62）%，与对照组相比差异显著（p<0.05），并且随浓度的增加其抑制的量效关系显著(图1).

bp<0.01 vs对照（n=3, x±s）.

图1 bgc823细胞经5?aza?cdr处理前后的生长曲线（略）

2.2 5?aza?cdr对细胞中xaf1基因mrna表达的影响 5?aza?cdr处理前bgc823细胞系的xaf1基因mrna不表达，在经5×103，10×103 nmol/l 5?aza?cdr处理后，xaf1基因mrna重新表达，10×103 nmol/l的5?aza?cdr处理组尤为明显，在用药48，72 h后，该基因表达呈明显上升的趋势(图2，3).

2.3 5?aza?cdr对细胞周期的影响 bgc823细胞经1×103，5×103，10×103 nmol/l 5?aza?cdr处理72 h后，s期的细胞数量逐渐增加，g2/m期细胞数下降，凋亡率明显增加 (表1).

m：50 bp dna ladder maker d512a；1：对照组；2～4：5×103 nmol/l 5?aza?cdr分别作用24，48和72 h；5～7：10×103 nmol/l 5?aza?cdr分别作用24，48和72 h.

图2 bgc823细胞经5?aza?cdr处理前后gapdh mrna的表达（略）

m：50 bp dna ladder maker d512a；1：对照组；2～4：5×103 nmol/l 5?aza?cdr分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.22，0.32，0.37)；5～7：10×103 nmol/l 5?aza?cdr分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.90，0.98，1.31).

图3 bgc823细胞经5?aza?cdr处理前后xaf1 mrna的表达（略）

表1 bgc823细胞经5?aza?cdr处理72 h后细胞周期的变化（略）

ap＜0.05, bp＜0.01 vs对照.

3 讨论

dna甲基化是由s?腺苷甲硫氨酸(sam)作为甲基供体，在细胞内甲基转移酶(dna methyltransferase，dnmt)的催化作用下，在胞嘧啶(c)的第五位碳原子上加上甲基基团，变成5?甲基胞嘧啶(5?mc)的化学修饰过程［3］. 近期 研究 表明，多种人类肿瘤在 发展 过程中表现异常dna甲基化模式，常见为甲基化酶水平提高、整个基因组范围甲基化减弱以及局部甲基化水平增高3种，以局部甲基化水平增强较多见［4］. xaf1基因定位于染色体17p13.2位点，研究表明，xaf1基因在多种肿瘤细胞株以及肝癌［5］、结肠癌［6］、黑色素细胞瘤［7］组织中表达降低，存在转录抑制现象，现已证明xaf1基因表达沉默与5′区域cpg岛异常高甲基化相关，转录过程中调控区域的cpg岛高甲基化导致xaf1基因表遗传修饰而失活. 我们采用不同浓度(5×103，10×103 nmol/l)的特异性dnmt抑制剂5?aza?cdr，对体外培养的胃癌bgc823细胞进行干预，rt?pcr结果显示在5?aza?cdr作用前，xaf1 mrna不表达，而在5?aza?cdr作用后，xaf1 mrna又重新表达，表达强度呈时间和剂量依赖关系，表明dna甲基化与基因遗传学改变不同，基因的缺失、突变等遗传学改变是不可逆的，而甲基化的dna核苷酸序列未发生改变，仅通过个别碱基的修饰来影响基因转录，因而是可逆的［8］. 因此我们通过5?aza?cdr人为的干预拮抗表遗传学改变，诱导因表遗传学改变而失活的xaf1基因表达，为去甲基化 治疗 肿瘤提供了 理论 基础.

凋亡在细胞增殖、肿瘤形成和发展中也起调控作用［9］. 我们 应用 不同浓度(1×103，5×103，10×103 nmol/l)5?aza?cdr诱导胃癌bgc823细胞后，mtt结果显示：细胞增殖受到明显抑制；流式细胞仪细胞周期 分析 可见s期的细胞数逐渐增加，g2/m期细胞数下降，同时细胞凋亡率明显增加呈时间和浓度依赖关系. 这一结果显示去甲基化后能使细胞阻滞于s期，而使得进入g2/m期的细胞减少，由此推断5?aza?cdr的去甲基化作用可通过影响细胞周期而抑制胃癌细胞的增殖；同时xaf1基因去甲基化后重新表达，它可直接结合并抑制xiap对caspase活性的抑制作用从而发挥诱导凋亡作用［2］，xaf1也是一种新的干扰素(ifn)诱导基因，其介导了ifn诱导凋亡的作用，并显著增强了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(trail)诱导肿瘤细胞凋亡的作用［10］.

【 参考 文献 】

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