乙型肝炎病毒感染与DNA甲基化

【摘要】 乙型肝炎病毒可引起肝脏肿瘤、肝硬化及肝炎等疾病。其引起肿瘤发生的重要机制-DNA甲基化日益引起人们重视。本文详细介绍了近年国内外对于乙型肝炎病毒感染与基因启动子甲基化之间关联的研究,进一步阐明了乙肝的作用机制,为进一步研究及临床治疗拓宽了思路。

【关键词】 乙型肝炎病毒;甲基化;肿瘤

DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.11.183

作者单位:266300山东省胶州市人民医院内五科

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒所引起的一种肝脏疾病,主要通过输血、注射和母婴传播。本病常导致慢性感染,是严重危害我国人民健康的重要传染病。HBV属于嗜肝病毒,整合于宿主肝细胞DNA中,通过宿主的免疫应答和反应引起肝细胞的损伤和破坏。许多病理学及流行病学资料证实,乙肝与肝硬化尤其是肝癌的发生有着密切的关系,如何使正常的肝细胞转化成异常乃至肿瘤细胞是我们目前研究的热点。

肿瘤生成主要有两大机制,一个是遗传学机制,通过DNA核苷酸序列改变而形成突变,另一个就是表遗传学机制,核苷酸序列不变而DNA突变,通过对个别核苷酸的碱基序列修饰导致基因的表达变化。其中一个重要的机制就是DNA甲基化,是表遗传学水平细胞开闭基因表达的一种重要方式。5-甲基胞嘧啶是脊椎动物中唯一的修饰碱基。在人类基因组中,甲基化CpG核苷酸分布有两种形式:一种分布于CpG岛区,常存在于基因5-端的基因调控区。另一种则散在分布。正常情况下,细胞CpG岛呈非甲基化状态,而其他散在分布的CpG二核苷酸成甲基化状态,即基因组的大部分基因的甲基化状态稳定,当其甲基化状态改变时,就会造成机体染色体不稳定或基因表达异常。启动子区域的CpG岛一般呈非甲基化状态,一旦呈现高甲基化,常导致基因转录沉寂,从而使抑癌基因、DNA修复基因丧失功能[1]。

目前随着多组抑癌基因的发现,人们也将乙肝病毒感染和抑癌基因的异常变化、修饰联系起来,近来比较热点的抑癌基因启动子异常甲基化成为乙肝病毒影响细胞异常变化的一个重要机制[2]。

有学者认为,乙肝病毒的感染与某些抑癌基因启动子的异常甲基化有关,不仅是在肝癌中可以观察到某些抑癌基因启动子的异常,在肝硬化、腺瘤及癌旁病变中甚至也可以观察到此种现象,而且以肿瘤最为显著,这就提示启动子异常甲基化与肿瘤的发生有着密切联系,同时这种异常甲基化与氧化应激相关[3]。负责DNA甲基化作用的酶叫作DNA甲基转移酶(DNMT),它对于维持人类染色体结构的稳定性,基因在亲代细胞间传递起着重要作用。不仅通过氧化应激,某些微卫星RNA(microRNA-152)也可以通过显著下调DNMT1表达致使抑癌基因GSTP1(glutathione S-transferase pi 1即谷胱苷肽S -转移酶P1 )和CDH1 (E-cadherin 1 即E-钙粘连素,在细胞周期调控中起重要作用)甲基化水平升高,影响其功能,导致肿瘤细胞的生成。而干预microRNA也成为干预肿瘤生成的另一途径[4]。不仅是单纯的某个抑癌基因启动子甲基化异常,有学者对多个抑癌基因在肝炎、肝癌及癌旁组织中进行研究发现,肝癌组织中CDKN2B异常甲基化的频率是肝炎对照组的2倍,其他抑癌基因APC, GSTP1, and CDKN2B显性表达的程度分别是对照组的2.2-, 2.3-, and 7.6-倍。而MYC基因的甲基化水平显著下降,此试验证实抑癌基因的异常甲基化确实与肿瘤的发生息息相关[5]。

由于乙型肝炎病毒的感染,不仅在体内发现其可以影响抑癌基因的启动子甲基化,在体外某些学者同样发现体外细胞中类似的现象,在感染了乙型肝炎病毒的细胞系中,DNA甲基转移酶的表达明显降低,(DNMT1, DNMT2, and DNMT3),抑癌基因SUFU (Suppressor of Fused )和 TIRAP(TIR domain-containing adapter protein胞浆内含有TIR区域的接头蛋白)表达下降,而这两种基因已经明确认为与肝脏肿瘤的发生密切相关,从另一个侧面证实了乙肝对人体的作用机制[6]。

HBV引起抑癌基因甲基化可能通过如下途径:当HBV-DNA整合于宿主基因组中时,可以引起宿主某些基因的缺失、易位和基因组的不稳定。在此过程中,HBX蛋白起着重要的作用。乙型肝炎病毒(HBV)X基因及其编码的多功能蛋白HBx是乙型肝炎病毒基因转录所必需的作用因子。同时,HBx通过与宿主功能蛋白直接或间接地相互作用而调节多种蛋白的功能,参与调控多条细胞信号通路转导,激活多种转录因子,在肝细胞抗凋亡和引发肝癌的过程中起重要作用. 有学者尝试将adr亚型HBx基因片段定向插入绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pEGFP-C1,构建重组体pGFP-HBx。将pEGFP-C1、pGFP-HBx转染HepG2细胞,采用G418筛选抗性克隆、荧光显微镜观察及RT-PCR检测HBx基因表达情况,用阿霉素分别处理HepG2、HepG2/GFP、HepG2/GFP-HBx细胞,处理36 h后,HepG2/GFP-HBx细胞凋亡率为3.94%,明显低于HepG2(59.03%)、HepG2/GFP细胞(61.38%)(P《0.01),而与未处理对照组细胞凋亡率(2.12%,2.78%,2.55%)差异无统计学意义。HBx能够抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡[7]。

肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)是一种具有广泛生物学效应的细胞因子,在机体炎症和免疫防御反应中起着重要作用,其中包括运动刺激所产生的机体反应.一种新型蛋白TTRAP被认为在TNF信号通路中有可能起重要作用。TRAF和TNF受体相关蛋白(TTRAP)是一种新的蛋白质,与胞浆区CD40和TNF受体相关因子(TRAFs)相互作用,可抑制NF-kappaB的激活,TTRAP是Mg2+/Mn2+-依赖的磷酸二酯酶超家族的一员,TTRAP与人APE1(一种Mg2+依赖的核酸内切酶)相关,在TNF受体家族介导的信号和功能中发挥着与APE1类似的DNA修复核酸内切酶的作用。因此推测TRAF和TTRAP与细胞信号转导、机体抗炎及抗肿瘤免疫相关,有学者发现,乙型肝炎病毒HBx蛋白抑制TTRAP启动子活性从而影响TNF的正常生理活性[8]。此外,其还可以通过诱导启动子异常甲基化使得维甲酸受体-beta2的表达下降,使肿瘤细胞对维甲酸的肿瘤抑制作用耐受,此种受体下调现象在肿瘤发生中异常常见,可能是HBx蛋白促进肿瘤生成的又一途径[9]。

对DNMT通路的影响也是HBx蛋白作用的另一重要机制。有实验证明,HBx蛋白可直接作用于DNMT3a,通过对其启动子的甲基化,使其表达静默,从而启动了另外基因CDH6 与 IGFBP3的转录表达,基因的表达水平与HBx蛋白成正相关。提供了HBX诱导肿瘤生成的可能机制[10]。

大量实验证实乙肝病毒可导致基因的启动子异常甲基化,从而在肝脏肿瘤、肝纤维化及肝炎的发生过程中起着重要作用。人们试图利用这一点,从反方面入手,试图在基因的甲基化异常发现来发现人体早期肿瘤。有学者已经证实,从血液中检测基因异常表达判断肿瘤和从活检病理方面判断的吻合性相当高,而且仅从血液检测方面加以明确为肿瘤的早期发现提供了广阔前景,大大减少了患者痛苦及治疗费用。该学者对28例肝癌患者同时进行了肝脏组织及血浆中抑癌基因组启动子甲基化的检测,其结果高度一致。其在活检组织及血浆中的表达如下APC (23/28, 82.1%, p=0.001), FHIT (24/28, 85.7%, p=.0001), p15 (25/28, 89.2%, p=0.045), p16 (19/28, 67.9%, p=0.037), E-cadherin (22/28, 78.5%, p=0.0008).这就为我们由血液检测早期肿瘤提供了依据。但是提示我们仍需要更多的大样本试验以为今后的血液检测早期肿瘤进行准备[11]。另有学者试验发现,外周血检测中,在P15/P16启动子甲基化均存在异常的肿瘤患者里,有高达75%的患者发生了肿瘤的远处转移,这提示外周血中P15/P16启动子甲基化的检测可以作为肿瘤的检测及预警指标[12]。还有学者在将63组肝癌及乙肝病毒感染的肝硬化患者及50例健康人相对比,发现抑癌基因RASSF1A在肿瘤血清中基因序列异常甲基化的阳性率高达93%,乙肝患者的阳性率为58%,而健康人仅为8%。RASSF1A在肝脏肿瘤及乙肝患者中的平均浓度是7.70 x 10(5) copies/L and 1.18 x 10(5) copies/L。在随后的随访过程中发现,部分患者乙肝患者发展为肿瘤的一年中,其血清RASSF1A的浓度异常升高[13]。

不仅在检测方面人们做出了很多努力,更重要的是人们在试图纠正此种异常机制。因为有DNA分子特定碱基结构修饰(epigenetic modification)机制的存在,异常基因的核苷酸序列并无异常,如果可以去除异常的甲基化修饰,整个核苷酸序列仍然是正常的。这就提示我们是否可以逆转基因的异常修饰如甲基化等,从而在基因水平为患者提供治疗。目前的反义RNA,乙肝siRNA以及某些药物等,正在进行此方面的尝试。但是因为药物的毒性限制,仅停留在实验阶段。目前DNMT反义基因的应用,在理论上可降低DNMT活性,从而使被高度甲基化失去活性的抑癌基因恢复活性,有可能成为肿瘤治疗的新途径之一[1~2]。

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