Vero/slam细胞在麻疹病毒分离中的应用

实施免疫规划是控制乃至消灭疫苗针对的传染病的主要策略。继人类消灭天花后，消灭脊髓灰质炎即将成为现实，世界卫生组织将麻疹列为下一个拟被消除的传染病。麻疹是一种严重危害儿童健康的急性呼吸道传染病，传染性极强，易引起爆发流行。麻疹病毒只有一个血清型，抗原性稳定，人感染后产生持久免疫力，人是唯一宿主，且有安全有效的疫苗加以预防。因此，消除麻疹在理论上是可行的。WHO美洲区已于2000年成功消除麻疹，WHO欧洲区和东地中海地区提出在2007―2010年消除麻疹。我国所在的西太平洋区所有国家承诺在2012年消除麻疹。在此背景下，省级麻疹网络实验室对麻疹病原学的监测工作愈发重要，而有稳定的、敏感的细胞系成为此项工作成败的关键。从最早使用的Vero细胞到2000年开始使用的B95a细胞，由于细胞自身的特点，或多或少影响了实验工作，如B95a细胞传代时分泌EB病毒，必须在生物安全柜内进行。该细胞维持时间短、易脱落，影响可观察CPE的时间，会造成假阴性。2005年，本实验室引进了Vero/slam细胞系。现将上海2004、2005年的56份疑似麻疹病人咽拭子标本同时接种Vero/slam细胞和B95a细胞，对两种细胞的生长特点，病毒分离结果作一个比较，将结果报道如下。

1材料与方法

1．1材料

1.1.1细胞系本实验所使用的Vero/slam细胞和B95a细胞均由中国疾病预防控制中心国家麻疹实验室提供，均为复苏后15代以内的传代细胞。Vero/slam细胞使用MEM培养液，营养液和维持液中分别含有10.0％和2.0％的胎牛血清及400μg/mL的遗传霉素（G418）。B95a细胞使用RPMI1640培养液，营养液和维持液中分别含有10.0％和2.0％的胎牛血清。

1.1.2标本使用2004年的14份和2005年的42份临床疑似麻疹病人咽拭子标本同时接种两种细胞。

1.2实验方法

将在细胞培养瓶中长满单层的两种细胞分别用营养液以1∶4稀释后加入24孔培养板，于36.5℃、5％CO2条件下培养。待24孔板中细胞长满单层后弃去营养液，加入200μL标本处理液37℃吸附1h后吸出，加入1mL维持液于36.5℃、5.0％CO2条件下培养，盲传3代，将CPE达到“＋＋＋”以上的毒株收集，经反复冻融3次后进行病毒滴定［1］。

2结果

2.1细胞培养及传代特点比较

B95a细胞贴壁不紧，边缘清晰，在传代过程中消化液中不加胰酶，消化时间少于2 min,经1∶4传代后2～3 d可长满单层，5d后开始有细胞圆缩脱落现象产生。

Vero/slam细胞贴壁紧密，边缘清晰，在传代过程中消化液中需加入胰酶，在37℃放置5～10min，经1∶4传代后3d可长满单层，能维持7d以上良好形态。

2.2两种细胞的病变特征

两种细胞的CPE均为融合病变，但形态不同。Vero/slam细胞的病变范围大，和B95a细胞的病变比较，相对不易脱落(图1)。

2.3病毒分离情况比较

实验共接种2004年14份和2005年42份疑似麻疹病人咽拭子标本，用B95a细胞分离到14份阳性标本，阳性率为25.0％；用Vero/slam细胞共分离到23份阳性标本，阳性率为41.1％，通过配对卡方检验得到P值为0.004，＜0.05。Vero/slam细胞的分离阳性率高于B95a细胞（表1）。

对于在两种细胞病毒分离中均呈阳性的14份标本的毒株，分别用两种细胞进行滴度测定，Vero/slam细胞最高为5.1 LogTCID50/100μL，最低为2.9LogTCID50/100μL，B95a细胞最高为4.4LogTCID50/100μL，最低为2.7LogTCID50/100μL（见表2）。对两种细胞的滴定值进行配对t检验，发现两种细胞的滴定值之间的差异无统计学意义(t=-0.18，P=0.86)。

以上所分离得到的毒株经RT-PCR和序列检测，均为目前我国流行的H1基因型。由结果看出,在B95a细胞分离得到阳性结果的14份标本，在Vero/slam细胞中均为阳性，Vero/slam细胞的阳性率高于B95a细胞，且经过序列分析，阳性标本均为麻疹野病毒H1型，说明Vero/slam细胞对于麻疹野病毒的敏感性优于B95a细胞且有良好的特异性。从病毒滴度测定的结果来看，两者分离到毒株的滴度互有高低，无明显差异。

3讨论

麻疹病毒细胞受体有CD46和SLAM两种［1,2］。CD46是麻疹病毒A组的主要受体，而非A组病毒由于基因在氨基酸481发生变异，由酪氨酸变异为其他氨基酸，导致非A组的所有麻疹病毒不再识别CD46受体［3］。Vero/slam细胞（CDW150）也叫信号淋巴细胞激活分子，是在一些T、B淋巴细胞上表达的细胞膜糖蛋白。用人SLAM互补的DNA转染能使麻疹病毒非敏感细胞系结合麻疹病毒，支持病毒复制，产生细胞病变效应［4］。Vero/slam细胞是将SLAM受体结合到vero细胞所得到的新的细胞系，既保持了Vero细胞对麻疹疫苗株的敏感性，又加强了对麻疹野毒株的敏感性。

Vero/slam细胞相对于B95a细胞的优势在于其对麻疹病毒的敏感性高，特异性很好，细胞易维持，病变明显易观察。Vero/slam细胞贴壁紧密、易维持的特点，延长了每一代病毒细胞分离反应的天数，到第7天时，细胞形态依然完好，而B95a细胞在5d后就开始圆缩、脱落，在形态上与病毒接种细胞(CPE)就很难区别，这也是相同实验条件下Vero/slam细胞在形态上观察病毒分离阳性率较高的原因之一。B95a细胞会分泌EB病毒，这使得在平时细胞传代中的生物安全要求高于Vero/slam细胞，这也阻碍了部分实验室开展麻疹病毒分离工作。

Vero/slam细胞的缺点在于为了保持SLAM受体的遗传活性，在传代所使用的培养液中要加入遗传霉素（G418），否则在2～3代后将丢失SLAM受体。G418目前价格较昂贵，给实验增加了一定的经济负担。G418的使用仅限于传代细胞的培养液和维持液中，而在用于接种标本的细胞的营养液和维持液中不需添加。G418有细胞毒性，使用前应先过滤，Vero细胞等其他细胞无法在添加了G418的培养液中生长，所以平时应注意防止污染。

Vero/slam细胞也可用于风疹病毒分离，但无明显病变，需配合荧光染色或RT-PCR及序列分析加以验证［5］。由于Vero/slam细胞易维持，不分泌EB病毒，对麻疹疫苗株、野毒株及风疹病毒均敏感，可以用一种细胞完成麻疹网络实验室在消除麻疹中对麻疹及风疹的病原学监测工作，可以替代目前日常使用的B95a细胞，成为麻疹网络实验室病毒学监测的主要细胞。

4参考文献

［1］WHO. Manual for the laboratory diagnosis of measles virus infection. 1999.

［2］Yanagi Y. The cellular receptor for measles virus-elusive no more［J］. Rev Med Virol, 2001, 11(3): 149-156.

［3］Hsu EC, Sarangi F, lorio C, et al. A single amino acid change in the hemagglutinin protein of measles virus determines its ability to bind CD46 and reveals another onmarmoset B cells［J］. J Virol 1998,72(4):2905-2916.

［4］Tatsuo H. The cellular receptor for measles virus［J］.Nature,2000,406(6789):893-896.

［5］朱贞. 一种新型诊断方法――比色法免疫学实验在检测风疹病毒中的应用研究［J］.中国计划免疫，2006，12（6）：489-493.

(收稿日期：2007-04-02)