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摘要 采用1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍基因突变法，得到大肠杆菌K-12的耐蛋氨酸类似物突变体。经过发酵测试，突变菌株获得1 020 mg/L的L-蛋氨酸产量。研究结果表明：L-蛋氨酸生物合成过程中的2个关键酶，即胱硫醚γ-合酶与胱硫醚β-裂解酶，在L-蛋氨酸发酵过程中未受到蛋氨酸的反馈阻遏。采用PCR方法对突变体的MetJ蛋白克隆并进行基因测序可知，野生型的第54位的丝氨酸基因被替换为天冬氨酰，使得反馈阻遏作用消除，从而有效提高L-蛋氨酸的发酵产量。
关键词 大肠杆菌；蛋氨酸阻遏蛋白；反馈阻遏；基因修饰；L-蛋氨酸产量
中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2014）05-0296-02
Effect of Gene Modification in Escherichia coli MetJ on Its L-met Production
YAN Hai-yang 1 LIN Song-yi 1 OUYANG Hong-sheng 2
（1 Quartermaster College，Jilin University，Changchun Jilin 130062； 2 College of Animal Sciences，Jilin University）
Abstract Gene mutation was carried out using N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine. L-met-analogue-resistant mutants were derived from Escherichia coli K-12. The mutants produced 1 020 mg/L L-met in the fermentation test. It was confirmed that two key enzymes，cystathionine γ-synthase and cystathionine β-lyase were not repressed by excess of L-met during fermentation. MetJ protein was cloned and sequenced by the PCR. It was observed that serine at position 54 was replaced by asparaginate，which enhanced L-met production because of the depression of L-met biosynthetic enzymes.
Key words Escherichia coli；MetJ；feedback repression；gene modification；L-met production
L-蛋氨酸作为人体和动物的一种必需氨基酸，被广泛应用于医药、食品、畜牧等产业。氨基酸是微生物的初级代谢产物，除胱氨酸和半胱氨酸外，其他氨基酸都可以采用微生物发酵法获得。微生物合成氨基酸的效率与菌体的自身条件密切相关，主要由以下几个方面决定：能否消除或降低微生物菌体本身的反馈调节；前体物的合成是否足量；氨基酸代谢物能否及时从发酵体系中移除。另外，外界发酵条件的控制也非常重要，例如：氧气溶解量[1]、生物素供应量、含硫量、各种无机盐含量等。
蛋氨酸、赖氨酸、苏氨酸和异亮氨酸都是天冬族氨基酸的家庭成员。本家族的各种氨基酸在不同微生物中的代谢途径在过去的几十年中已经被众多学者详细阐述过。Rowbury et al在1961年详细阐述了大肠杆菌中天冬族氨基酸的代谢途径[2]（图1）。
在合成蛋氨酸的支路途径中，涉及到众多的酶催化相应的反应：Met A，MetB，MetC，MetE[3]。蛋氨酸阻遏蛋白（MetJ）对上述各种酶都有反馈阻遏作用[4-5]，限制蛋氨酸积累量的增加。生成的蛋氨酸会在蛋氨酸合成酶（MetK）的作用下转化为S-腺苷蛋氨酸[6]。
在以往的研究中，涉及很多关于MetJ蛋白对L-蛋氨酸合成体系的反馈阻遏作用，但较少探讨基因修饰对解除MetJ蛋白反馈阻遏作用的影响，本研究通过对大肠杆菌MetJ第54位氨基酸残基的替换，使蛋氨酸对胱硫醚γ-合酶与胱硫醚β-裂解酶（蛋氨酸合成过程中的2个关键酶）反馈阻遏作用的解除，对提高微生物L-蛋氨酸产量有着重要的意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌体与质粒。大肠杆菌K-12为来自于吉林大学军需科技学院实验室保存菌种；含有氨苄青霉素抗性基因的载体质粒pBR322、pUC19均购自Novagen公司。
1.1.2 培养基。蛋白胨、酵母浸粉、氯化钠、琼脂、亚硝基胍、磷酸缓冲液、DL-乙硫氨酸、DL-正亮氨酸等试剂均购自Sigma公司。
1.1.3 仪器与设备。LC-2010高效液相色谱仪购自岛津公司。
1.2 试验方法
1.2.1 抗L-蛋氨酸类似物突变体的筛选。收集对数后期的大肠杆菌K-12，用0.5 mg/mL含有1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍的磷酸缓冲液（pH=7）进行诱变。诱变后的菌体涂抹在3个基本培养基平板上，平板上蛋氨酸类似物（DL-乙硫氨酸、DL-正亮氨酸）的浓度分别为：1、3、5 mg/mL。于37 ℃条件下，经过48 h培养后，对得到的阳性菌落进行L-蛋氨酸的发酵试验。
1.2.2 L-蛋氨酸的发酵与含量的测定。将筛选出的具有抗蛋氨酸类似物的突变体在含有50 μg/mL氨苄青霉素的液体基本培养基M1（1 L蒸馏水中溶解30 g葡萄糖、2 g KH2PO4、10 g（NH4）2SO4・7H2O、10 mg MnCl2・4H2O、10 mg FeSO4・4H2O及20 g CaCO3，pH=7）中培养。接种到20 mL的M1培养基中，置于120次/min的摇床上，于30 ℃培养48 h，对发酵液进行氨基酸测定。氨基酸的测定采用HPLC的柱前衍生法。
1.2.3 PCR基因克隆。为了分析MetJ序列的变化，采用PCR方法对此段基因序列进行克隆。引物设计如下：上游引物：5′-CGGGGTACCACGCGT-CATGTGATGAAG-3′，下游引物：5′-TGCTCTA-GATTATCCGGCCTACAAGTT-3′。
将50 ng基因组DNA 加入到10 μL的10×PCR缓冲液（100 mmol/L Tris/HCl，pH值8.3，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2）中，加入2.5 mmol/L的三磷酸脱氧核苷酸8 μL，再加入1 μL的1 mmol/L上述2种引物、2.5 U的Taq DNA聚合酶，用蒸馏水定容至100 μL。然后，进行25个循环的基因扩增（95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min），大小为725 bp的唯一PCR扩增带被KpnI和XbaI酶切后，将酶切产物连接到pUC19载体的相应酶切位点上，然后通过美国应用生物系统公司生产的373A DNA测序仪，采用双脱氧DNA链终止法进行核苷酸序列测定。测序引物为5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′，5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′和5′-CCCACATCAACTG TGTGGT-3′，对每个菌株3个独立的克隆进行分析。
1.2.4 胱硫醚-γ-合酶与胱硫醚-β-裂解酶活性分析。将突变菌体置于50 mL的M1基础培养基中，于30 ℃培养24 h，达到对数后期，用50 mmol/L Tris/HCl缓冲液（pH=7.5）洗净，重悬于4 mL的2 mL二硫苏糖醇中，8 000 r/min离心20 min，收集到待测蛋白。2种酶的活性测定根据李丽帆、曹珊珊等所提供的方法[7-8]。
2 结果与分析
2.1 抗蛋氨酸类似物突变体的筛选
DL-乙硫氨酸和DL-正亮氨酸都是筛选抗阳性突变体的有效类似物。在3个基本培养基平板上共产生约2 000个阳性菌落，从中选取10个（编号为N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、N10），在M1基本培养基中培养后，进行L-蛋氨酸产量测定，测定结果如表1所示。
选取N1菌落，向M1培养基中添加不同浓度的酵母浸粉，进行48 h培养后发现，L-蛋氨酸产量明显增加，结果如表2所示。
2.2 胱硫醚-γ-合酶与胱硫醚-β-裂解酶的活性
分别对大肠杆菌K-12野生菌株和突变体N1中的胱硫醚-γ-合酶与胱硫醚-β-裂解酶的活性进行测定，测定结果如表3所示。由表3可知，通过对MetJ蛋白的基因修饰，胱硫醚-γ-合酶与胱硫醚-β-裂解酶的活性较野生菌体有了很大的提高。
3 讨论
在大肠杆菌发酵生产氨基酸的途径中，存在着复杂的反馈抑制和反馈阻遏现象，这也是包括L-蛋氨酸在内的各种氨基酸高产过程中面临的最大障碍。野生菌株通常情况下无法大量积累代谢产物，因此利用基因工程手段，改变调控机制，从而获得抗反馈抑制与反馈阻遏的突变体，可以有效地实现L-蛋氨酸等氨基酸的高产。蛋氨酸类似物被广泛用于分离蛋氨酸高产菌株，能够抵抗蛋氨酸类似物的突变体具有对反馈抑制和反馈阻遏不敏感的酶，可以有利于大量的积累蛋氨酸[9]。
通过对MetJ蛋白的基因修饰，胱硫醚-γ-合酶与胱硫醚-β-裂解酶的活性较野生菌体有了很大的提高，从而大大提高了菌体的L-蛋氨酸产量。通过PCR结果分析可知，基因突变作用导致了MetJ蛋白上的第54位的丝氨酸被天冬酰胺替换，可以推断天冬酰胺残基对去除MetJ蛋白对蛋氨酸合成的反馈抑制作用有着很大的效果。众所周知，第54、56、60位的残基位于双螺旋结构的氨基酸末端区域，对与操纵区段的DNA磷酸盐的相互作用起着重要的作用。第54位替换可能导致了DNA磷酸和第54位残基侧链的空间干扰。这种作用可能导致了DNA蛋白复合物的结合能力与稳定性，有待于进一步研究。
大肠杆菌的蛋氨酸合成基因操纵子受到MetJ和MetK的消极调控，在本研究中对MetJ的破坏作用促进了L-蛋氨酸产量的提高，类似的研究也曾报道过，例如：通过对丝氨酸乙酰转移酶蛋白的修饰，有效的提高了大肠杆菌中L-半胱氨酸的产量[10]。半胱氨酸为蛋氨酸的生物合成提供硫源，因此，可以推断本研究涉及的是丝氨酸乙酰转移酶蛋白的修饰作用间接促进了L-蛋氨酸产量。相关研究有待进一步开展。
4 参考文献
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[8] 曹珊珊，牛卫宁，羊梦林，等.胱硫醚-β-裂解酶的表达纯化与性质研究[J].化学与生物工程，2011，28（9）：27-30.
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