HPLC―TOF―MS对中药石见穿化学成分的快速鉴别

[摘要] 运用高效液相-高分辨飞行时间质谱（HPLC-TOF-MS）技术对中药石见穿化学成分进行了快速鉴别。色谱分离采用SHISEIDO MG C18（3.0 mm×100 mm，3 μm）色谱柱；流动相为乙腈（A）和水（含0.1%甲酸，B），梯度洗脱，A相比例随时间的变化：10%～90 %（0～33 min），90%（33～40 min）；柱温25 ℃；流速0.6 mL・min-1，柱后分流比为2∶1。质谱定性采用飞行时间质谱，电喷雾离子源（ESI），正离子模式，扫描范围m/z 100～1 000。最后，一次性鉴别出石见穿中28种的化学成分。该研究建立了一种基于HPLC-TOF-MS技术对石见穿中的化学成分进行快速鉴别的方法，为中药石见穿的质量控制及体内的深入研究奠定了基础。

[关键词]石见穿；化学成分；鉴别；飞行时间质谱

石见穿为唇形科植物华鼠尾草Salvia chinensis Beth.的干燥地上部分，广泛分布于江苏、安徽、江西、湖北、湖南、广东、广西、四川、云南等地，其性凉，味微苦、辛、平，归胃、肝、肺经[1]。临床研究表明[2-3]，石见穿治疗肝炎、癌症及妇科疾病疗效显著，这与其所含特有的化学成分相关，石见穿亦为本院抗癌基本方“清肝散结颗粒”的君药成分，明确石见穿的化学成分对于药材的质量控制及临床应用具有重要意义。到目前为止，对石见穿中化学成分分析以传统的植物化学分离提取的方法居多[4-8]。HPLC与TOF-MS串联技术对于中药复杂体系中化学成分分析和鉴定非常有效[9-10]，它可在短时间获得化合物的准确相对分子质量，通过比对已建立的已知化学成分数据库对被测成分进行快速分析鉴别，相比于传统的中药分离手段具有显著的优越性。本研究运用HPLC-TOF-MS技术快速鉴别出石见穿中28种化学成分，是国内首次报道的运用高效液相与TOF-MS联用技术对石见穿中化学成分的定性分析和鉴别。

1材料

1.1仪器 Agilent 1100系列高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），配有在线脱气机，四元泵，自动进样器，柱温箱和二极管阵列检测器；Agilent 6220 高分辨飞行时间质谱仪（美国安捷伦公司），配有标准电喷雾离子源（ESI），分析软件为MassHunter Data Acquisition在线工作站和Qualiative Analysis离线分析软件。DJ-04药材粉碎机（上海淀久公司）；METTLER AE240型1/10万电子天平（瑞士梅特勒公司）；KUDOS-SK2200H 超声发生器（上海科导超声仪器公司）。

1.2药品与试剂 迷迭香酸（批号111231-201019），积雪草酸（批号110892-201004），齐墩果酸（批号110709-201005）和熊果酸（批号110742-201016）对照品购自中国食品药品检定研究院（纯度>99.0%），乙腈和甲酸为色谱纯（Fisher，USA），其余试剂均为分析纯，水为纯水。3批石见穿药材分别为产地湖北黄石，购自上海雷允上大药房，批号20120801；产地安徽亳州，产地收集，批号20120301；产地江西樟树，产地收集，批号20120501。3批药材经第二军医大学生药教研室黄宝康副教授鉴定为唇形科植物石见穿S. chinensis的干燥地上部分。

2方法和结果

2.1对照品溶液的制备 精密称取迷迭香酸，积雪草酸，齐墩果酸和熊果酸对照品5.15，5.21，5.30，5.06 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释定容，配成质量浓度分别为515，521，530，506 mg・L-1的混合母液，精密吸取母液1 mL置于100 mL量瓶，加甲醇定容后，即得对照品混合溶液。

2.2供试品溶液的制备 精密称取石见穿药材粉末100 g（过40目筛），置3 000 mL圆底烧瓶中，加70%乙醇1 000 mL，加热回流处理2 h，放置室温，补足失重，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得石见穿样品溶液。

2.3色谱条件 SHISEIDO MG C18色谱柱（3.0 mm×100 mm，3 μm）；流动相为乙腈（A）和水（含0.1%甲酸，B）；梯度洗脱，0～33 min，10%～90%A，33～40 min，90% A；进样量5 μL；流速0.6 mL・min-1；柱温25 ℃；柱后分流比为2∶1。

2.4质谱条件 采用ESI源，正离子模式，雾化气为高纯氮气。具体质谱参数：毛细管电压3 500 V，干燥气温度350 ℃，干燥气流速10 L・min-1，雾化气压力275 kPa，碎片电压180 V；参比离子m/z 121.050 8，922.009 7；扫描范围m/z 100～1 000。测定样品之前，使用调谐液校准质量轴，以保证质量精度误差小于1×10-6。

2.5石见穿化学成分数据库的建立 根据国内外专业数据库Pubmed，ChemSpider，中科院化学专业数据库等及国内外相关研究文献，收集了石见穿各种化学成分名称及分子式共40个。采用安捷伦“formula-database generator”软件（含各元素精确质量数），根据各成分碳、氢、氧的个数，计算精确相对分子质量，建立了包括化合物名称、分子式、相对分子质量、M+H和M+Na准分子离子峰相对分子质量的相应的化学成分数据库。

2.6石见穿总离子流图 根据2.2项下的样品处理方法处理样品，并根据2.3和2.4项下的色谱质谱条件进样，得石见穿样品溶液的总离子流图，见图1（批号20120801） 。

2.7利用对照品鉴别化合物 实验中利用已有的4个对照品，无偏差的鉴别出迷迭香酸（峰16）、积雪草酸（峰22）、齐墩果酸（峰26）和熊果酸（峰27）4个化合物，混合对照品的总离子流图见图2。

2.8利用精确质量数和同位数分布鉴别化合物 以11号峰山柰酚为例说明石见穿中色谱峰的鉴别过程。保留时间为11.82 min色谱图中的准分子离子为287.052 9。利用Qualiative Analysis数据分析软件的计算工具（calculator）计算精确质量数的可能元素组成（误差

2.9石见穿中化学成分的鉴别结果

根据飞行时间质谱测得精确的相对分子质量，比对所建数据库，应用Qualiative Analysis质谱分析软件计算分子组成，将理论值与实测值进行比对，结合上述对照品鉴别结果及相关文献报道[2-8]，对石见穿药材在正离子模式下所得色谱图中色谱峰进行分析，初步鉴别出28个化学成分，结果见表1。对于部分未区分的同分异构体，后期可考虑调节碎片电压获得化合物的裂解规律进行区分。

3讨论

3.1提取条件优化 对于提取方法，本试验考察了超声法和回流法。结果发现回流法可获得的峰容量明显高于超声法。对于提取溶剂，由于石见穿主要成分为三萜类，根据其成分特点，考察了甲醇，50%甲醇以及70%乙醇，发现采用70%乙醇提取获得的峰容量最大，故采用70%乙醇回流2 h为提取方法。

3.2色谱质谱条件优化 对色谱条件的摸索，考察了甲醇-水、乙腈-水系统，发现乙腈的洗脱效果优于甲醇，且各色谱峰分离效果更好，加入0.1%甲酸可以改善峰拖尾，并提高质谱响应。故采用乙腈-水（含0.1%甲酸）为流动相。质谱检测比较了正、负离子两种扫描模式，结果发现正模式下峰容量大、质谱响应更好，故实验最终选择在正模式下进行。

3.3小结 本文运用HPLC-TOF-MS技术快速鉴别出石见穿中28种化学成分。该方法在传统的植物化学分离提取基础上对色谱峰进一步明确化，为石见穿药材的质量控制及体内的深入研究奠定了良好的基础。

[参考文献]

[1] 王艳宏，关枫，王锐. 中药石见穿研究进展[J]. 中国药房，2006，17（24）：1909.

[2] 徐敬宣，薛姣，钱晓萍，等. 石见穿的化学成分及抗肿瘤作用研究进展[J]. 现代肿瘤医学，2011，19（3）：587.

[3] 雷涛，孟繁钦，王艳芳，等. 石见穿化学成分及药理研究进展[J]. 中国医药导报，2010，7（29）：9.

[4] 王业玲，李占林，刘涛，等. 石见穿化学成分的分离与鉴定[J]. 沈阳药科大学学报，2009，26（2）：110.

[5] 高俊峰，丁玲，张鹏，等. 石见穿化学成分研究[J]. 中国中药杂志，2013，38（10）：1556.

[6] 刘环香，苏汉文，向梅先. 石见穿药材醋酸乙酯部位化学成分的研究[J]. 中国医院药学杂志，2010，30（19）：1657.

[7] Wang Y，Li Z，Zhang H，et al.New germacrane sesquiterpenes from Salvia chinensis[J].Chem Pharm Bull，2008，56（6）：843.

[8] Liu C P，Fang J N，Li X Y，et al. Structural characterization and biological activities of SC4，an acidic polysaccharide from Salvia chinensis[J].Acta Pharmacol Sin，2002，23（2）：162.

[9] Zhao L，Lou Z Y，Zhu Z Y，et al.Characterization of constituents in Stellera chamaejasme L. by rapid-resolution liquid chromatography-diode array detection and electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry [J].Biomed Chromatogr，2008，22：64.

[10] Zhang H，Gong C G，Lv L，et al.Rapid separation and identification of furocoumarins in Angelica dahurica by high-performance liquid chromatography with diode-array detection，time-of-flight mass spectrometry and quadrupole ion trap mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2009，23：2167.

Rapid identification of chemical constituents in

Salvia chinensis by HPLC-TOF-MS

ZHOU Yan-ni， ZHAO Liang， ZHENG Lei， LV Lei*

（Department of Pharmacy， Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital， Shanghai 200438， China）

[Abstract] It′s established a high-performance liquid chromatography-time of flight mass spectrometry（HPLC-TOF-MS）method to analyze chemical constituents in Salvia chinensis. The separation was performed on a SHISEIDO MG C18 reverse phase column（3.0 mm×100 mm，3 μm）.The mobile phase consisted of acetonitrile（A） and water （containing 0.1% formic acid，B） was used as gradient elute.The gradient of a phase，10%-90%（0-33 min），90%（33-40 min）. The flow rate was 0.6 mL・min-1. Post-column split ratio was 2∶1. Temperature of column was 25 ℃. Time-of-flight mass spectrometer（TOF-MS） and electrospray ion source（ESI） was applied for qualitative analysis under positive ion mode，and mass scan range was m/z 100-1 000. As a result，28 of the major chemical constituents of S.chinensis were identified by HPLC-TOF-MS. In this study，a rapid and efficient method for studying the chemical constituents in S.chinensis by HPLC-TOF-MS was established，which paves a way for the quality control and further studies of the herb in vivo.

[Key words] Salvia chinensis； chemical constituents； identification； TOF-MS

doi：10.4268/cjcmm20132324