地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1的克隆和表达分析

[摘要] 为了克隆地黄Aux/IAA家族基因RgIAA1，分析地黄RgIAA1的时空表达特性及对逆境胁迫的响应。以拟南

>> Aux/IAA和ARF蛋白对植物侧根形成的影响 地黄酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析 草莓NBS-LRR家族基因FaNBS1的克隆与表达分析 肾与地黄丸的家族 生地黄的故事 地黄丸家族“六兄弟” 帮您认识地黄丸家族 洋地黄中毒１例报告 超量服用洋地黄致死1例 生地黄的药效分析 拟南芥Ｒａｂ１家族基因的克隆和功能研究 洋地黄中毒3例分析 地黄丸的种类及用途 地黄的种植与管理技术 天蓝地黄曲苍凉的陕北民歌 地黄块根膨大发生和驱动的组织观察及激素相关基因的调控分析 龙眼水通道蛋白基因(DLPIP1)的克隆与表达分析 大鼠UQCRFS1基因的克隆及其表达模式分析 烟草WRKY―R1基因的克隆及瞬时表达分析 三七几丁质酶基因PnCHI1的克隆及表达特性分析 常见问题解答 当前所在位置：l）查找基因开放阅读框（ORF）。应用SMART在线工具（http：//smart.embl.de/）分析氨基酸序列结构域，相似性搜索应用NCBI在线软件BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行。氨基酸多序列联配用Clustal Omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/），进化树构建利用在线分析软件MAFFT（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/），先进行多序列联配，保存FASTA格式，然后用MEGA 5.02软件打开并以Neighbor-Joining算法进行bootstrapping分析，构建系统发生树。

1.5基因表达检测 时空表达模式分析：提取地黄“温85-5”膨大初期块根、不定根、茎、幼嫩叶、展开叶和衰老叶的总RNA，反转录成cDNA模板，以Rg18S为内参基因，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法检测基因的表达量。

胁迫下表达水平检测：提取不同胁迫处理叶片的总RNA用于qRT-PCR检测。所用PCR仪为BIO-RAD iQ5（伯乐，上海）。根据候选RgIAA1基因CDS序列信息设计特异引物5′-GTGGTTCTCAAGGGCTGAAG-3′和5′-CCATGGAACATCACCGACAA-3′，以Rg18S作为内参基因，引物序列为5′-GTTCTTAGTTGGTGGAGCGATT-3′和5′-CAGACCTGTTATTGCCTCAAAC -3′。实时荧光定量分析试剂盒为SYBR Premix Ex Taq II （Tli RNaseH Plus） （Takara，大连）。PCR扩增体系：SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，正向引物和反向引物（10 μmol・L-1）各1 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL，共计25 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

2结果与分析

2.1RgIAA1基因克隆 在转录组EST数据库中，通过同源搜索、拼接延伸，获得1条包含903个碱基的cDNA序列，检索发现其包含1个681 bp的开放阅读框（ORF），编码226个氨基酸，5′非编码序列（UTR）有206 bp，3′UTR有16 bp，命名为RgIAA1。根据其编码区序列设计特异引物，以地黄叶片cDNA为模板扩增出1条681 bp的条带（图1）。

2.2RgIAA1的序列特征 应用ExPASy（http：///protparam/）计算发现RgIAA1蛋白的相对分子质量为24.7 kDa，等电点pI 5.41。应用SMART在线工具分析其结构域，发现从第10个氨基酸到第225个氨基酸的Aux/IAA家族蛋白结构域。利用RgIAA1蛋白的氨基酸序列在NCBI上进行BLASTP同源搜索，获得30个扩展蛋白，分属22个植物物种。应用Clustal Omega在线软件对31个蛋白进行多序列联配，结果表明，31个Aux/IAA蛋白包含多个高度保守的结构域，其中结构域Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ（图2）为Aux/IAA蛋白功能结构域，在结构域I和II之间还有1个由两部分氨基酸序列组成的核定位信号（NLS），结构域Ⅳ内也含有一个NLS。次级结构预测表明，RgIAA1及其同源蛋白还包含1个β折叠和2个α螺旋α1和α2组成的βαα模体（motif）。由此可见，RgIAA1具有Aux/IAA蛋白的典型特征。

2.3系统进化分析 在NCBI上检索到29个拟南芥Aux/IAA家族蛋白，通过与RgIAA1构建进化树，发现RgIAA1与AtIAA14（NP_193191.2），AtIAA16（NP_187124.1），AtIAA7（NP_188945.1），AtIAA17（NP_171921.1）属于同一个亚家族I（图3-A）。其中与AtIAA16序列相似程度最高，一致性达到64%，其次为AtIAA14，一致性达到62%。

通过与RgIAA1进行进化分析，结果表明，31个Aux/IAA可初步分为2个类群，小的类群包含4个蛋白，来源于单子叶植物水稻、玉米Zea mays、短柄草Brachypodium distachyon、粟米Setaria italica；大的类群包含27个蛋白，分属于19个物种，均为双子叶植物。AtIAA7，AtIAA14，AtIAA17，VvIAA14（XP_002284133.1），TcIAA7（EOY05882.1），TcIAA14（EOY05883.1），MpIAA14（BAH15071.1），GmIAA14（XP_003556389.1）属于1个群组――Group I；GmIAA28（XP_003521268.1），LjIAA（AFK36086.1），RcIAA28（XP_002520980.1），VvIAA28（XP_002281771.1）属于1个群组――Group II，应为IAA28群组；AtIAA16（NP_187124.1），GmIAA16等12个蛋白属于1个群组――Group III，应为IAA16群组。RgIAA1属于双子叶植物，但是与其他双子叶植物Aux/IAA蛋白亲缘关系相对较远，单独为一个分支。与番茄Solanum lycopersicum SlIAA16（XP_004230093.1）和马铃薯Solanum tuberosum StIAA3（ACV31209.1）的相似程度最高，一致性均为70%（图3-B）。

2.4RgIAA1的时空表达模式 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果表明，RgIAA1在地黄不同组织中的表达呈差异表达，其中在地黄幼嫩叶片里表达强度最大，其次为茎，且幼嫩叶片较茎中的表达量高3.76倍。在不定根和衰老的叶片中表达都弱（图4），其表达量分别为幼嫩叶片的1.0%，1.1%。而且，从图4中可以看出，随着叶片的伸展，RgIAA1表达强度不断降低，说明RgIAA1在叶片的伸展中发挥重要的作用。在膨大的块根中表达相对较弱，显示其在块根的发育过程中可能发挥的作用相对较小。

2.5逆境胁迫下RgIAA1的表达 为了探讨RgIAA1在逆境胁迫下与地黄发育的关系，以qRT-PCR检测了其在连作、2% NaCl和渍水处理等3种逆境下的表达量。结果表明，在连作条件下，地黄叶片内RgIAA1的表达量显著升高。而在NaCl和渍水胁迫下，地黄叶片内RgIAA1的表达量均显著降低，且NaCl胁迫下的表达降低程度达到极显著水平（图5）。

3讨论

Aux/IAA基因的功能相似性和差异主要是由它们的编码的蛋白及其表达模式决定的[13]。具有保守的结构域是Aux/IAA家族蛋白的共有特征[9，14]。但是不同物种中均发现也有少数Aux/IAA蛋白有不同程度的保守结构域缺失，导致其被赋予新的功能而不再参与生长素的信号响应，或者形成假基因[15]。拟南芥Aux/IAA蛋白AXR3的不同结构域的功能缺失突变体表型发生不同程度的变异，证实保守的结构域对于Aux/IAA蛋白响应生长素信号调节植物的生长发育极为重要[16]。本研究以AtIAA14的cDNA为探针获得了RgIAA1的序列，进化树分析表明， RgIAA1与拟南芥AtIAA7，AtIAA14，AtIAA16，AtIAA17的同源性虽然都比较高，但与AtIAA16的同源性最高（图3A），说明RgIAA1是AtIAA16的直系同源基因。不同物种同源蛋白的进化分析表明，RgIAA1与双子叶植物Aux/IAA蛋白的序列相似度较高，与单子叶植物Aux/IAA蛋白的序列相似度较低，符合物种进化规律。

基因的表达特性与其功能之间密切相关。虽然不同的Aux/IAA蛋白功能存在差异，但是Aux/IAA基因功能特异性主要受转录水平的调控[17]。研究表明，拟南芥、水稻、玉米、番茄等物种的多个Aux/IAA基因在不同组织中或在外源生长素和光刺激下呈差异表达[16，18-20]。本实验发现RgIAA1在地黄的幼嫩叶片里表达量最高，其次为茎。随着叶片的展开、衰老，RgIAA1的表达量不断降低，这与随着草莓Fragaria×ananassa cv. Toyonaka果实发育FaIAA1，FaIAA2的表达量不断降低一致[21]。薛建平等[10]发现IAA在地黄叶和茎中含量较高，而在块根中含量较低，认为高浓度的IAA 有利于延缓叶片的衰老，从而有更多的光合产物形成并转运到根部参与块根的形成。

Aux/IAA基因不但能够对外源激素和光刺激作出响应，在逆境胁迫下的转录水平也会发生改变。Song等[22]分析了不同逆境胁迫下的水稻Aux/IAA家族基因表达谱，发现干旱和盐胁迫下多个基因呈上调或下调表达。Jain等[23]发现高盐条件下水稻OsIAA9，OsIAA20的上调表达。Wang等[24]在盐处理的高粱根中也观察到SbIAA2，SbIAA24的差异表达。akir等[25]则发现葡萄Vitis vinifera VvIAA4在盐和干旱胁迫后0～24 h的表达量不断降低。本实验中，RgIAA1在连作下表达量升高，而在盐和渍水胁迫下表达量降低。连作也是一种胁迫[26]，连作地黄表现产量降低、品质变差等[27]。淹水和盐胁迫也是不利地黄生长的主要环境因素。虽然3种逆境对于地黄的生长发育均是不利的，但是，相对而言渍水和盐胁迫对地黄的伤害较大，盐处理8 h、渍水处理3 d后部分叶片开始萎蔫，而连作胁迫对地黄的伤害是一种相对缓慢的过程，一般出苗后30～50 d才会出现生长受阻的表型。因此，RgIAA1转录水平可能与地黄响应3种不同逆境的分子机制有关，具体原因有待于进一步研究。已经构建了RgIAA1的过量表达和抑制表达载体，目前正在进行遗传转化，以期从分子水平揭示RgIAA1调控地黄产量、品质形成和响应逆境胁迫的分子功能。

[致谢] 徐伟、马萌辉和闫士猛同学协助完成地黄逆境胁迫处理工作。

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Molecular cloning and expression analysis of an Aux/IAA gene

（RgIAA1） from Rehmannia glutinosa

WANG Feng-qing1，3， TIAN Yun-he1， LI Ming-jie2， YANG Jin-feng1， ZHANG Bao3，

LIN Wen-xiong3， CHEN Xin-jian2， ZHANG Zhong-yi2，3*

（1.Agronomy College of Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China；

2.Institute of Chinese Medicinal Materials， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China；

3.Institute of Chinese crude Drugs GAP， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China）

[Abstract] To clone and analyze a member of the Auxin/indole-3-acetic acid（Aux/IAA） gene family， RgIAA1， from Rehmannia glutinosa. The transcriptional EST database of R. glutinosa was used to clone the new Aux/IAA gene by cDNA probe of AtIAA14. Bioinformatics was applied to analyze the sequence characteristics of RgIAA1 protein and construct phylogenetic trees. Quantitative RT-PCR has been applied to detect the transcription level of RgIAA1 in seven tissues as well as in leaves under three stresses. The results showed that， the cDNA sequence of RgIAA1 contains 903 bp was obtained. The open reading frame （ORF） of RgIAA1 was 681 bp encoding 226 amino acids， which has typical structural domains and characteristic sequence of Aux/IAA family proteins. RgIAA1 showed the highest expression level in unfolded leaf， followed by the stem. And the expression of RgIAA1 was quickly decreased with leaf growing up. The transcription level increased under continuous cropping conditions while it reduced both in salinity and waterlogging stresses. RgIAA1， an Aux/IAA gene from R. glutinosa has been obtained for the first time， which can lay the foundation for further studies about its molecular function in development and responses to stress.

[Key words] Rehmannia glutinosa； Aux/IAA gene； sequence characteristics； expression analysis

doi：10.4268/cjcmm20132308