CCN2对人牙髓干细胞增殖及分化的影响

[摘要] 目的 探讨CCN2对体外培养的人牙髓干细胞增殖、分化的影响。 方法 收集在延安大学附属医院口腔修复科因正畸或阻生而拔除的牙齿，酶消化法获得人牙髓干细胞，光镜下进行形态学观察，免疫荧光法检测细胞表面标志蛋白的表达。取对数生长期牙髓干细胞，加入不同浓度的CCN2将其分为CCN2 6.25、12.5、25、50、100 μg/L组，同时设置阴性对照组；采用噻唑蓝（MTT）法检测CCN2对牙髓干细胞增殖作用的影响，通过碱性磷酸酶及Western blot检测CCN2对牙髓干细胞分化的影响。 结果 人牙髓干细胞呈集落状生长，免疫荧光法检测STRO-1呈阳性表达，CCN2 6.25、12.5、25、50、100 μg/L组OD值分别为（0.78±0.05）、（0.91±0.03）、（1.23±0.09）、（1.57±0.11）、（1.61±0.15），均高于对照组（0.51±0.02），差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；细胞增殖实验表明，CCN2可显著促进牙髓干细胞的增殖；此外，CCN2可促进牙髓干细胞碱性磷酸酶的活性，并呈现浓度依赖关系，CCN2 6.25、12.5、25、50、100 μg/L组OD值分别为（0.32±0.04）、（0.43±0.04）、（0.61±0.03）、（0.79±0.06）及（0.81±0.07），与对照组（0.19±0.03）比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）；Western blot结果表明，CCN2可诱导牙本质细胞特异性标志蛋白的表达。 结论 CCN2可促进牙髓干细胞向成牙本质细胞的分化。

[关键词] CCN2；人牙髓干细胞；增殖；分化

[中图分类号] R783.4[文献标识码] A[文章编号] 1673-7210（2014）06（a）-0024-04

Effects of CCN2 on the proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells

WANG Junqiang CAO Weijing

Department of Prosthodontics， Affiliated Hospital of Yan′an University， Shaanxi Province， Yan′an 716000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of CCN2 on proliferation and differentiation of human dental pulp stem cells （hDPSCs）. Methods Teeth were collected from patients with orthodontics or impaction in Department of Prosthodontics of Affiliated Hospital of Yan′an University. The hDPSCs was separated with enzyme digestion. Morphological observation of hDPSCs were observed under light microscope and the expression of surface marker protein was determined with immunofluorescence. Different concentrations of CCN2 were added into hDPSCs of logarithmic phase， and divided into different groups： CCN2 6.25， 12.5， 25， 50， 100 μg/L group， meanwhile the cells not treated with CCN2 as negative control group. MTT assay was used to evaluate the proliferative effects of CCN2. The activity of alkaline phosphatase and the expression of odontoblasts marker proteins were determined to assess the effects of CCN2 on differentiation of hDPSCs. Results The human dental pulp stem cells with colony growth， Immunofluorescence test showed that the expression of STRO-1 was positive. MTT assay showed that CCN2 could significantly promote the proliferation of hDPSCs， as compared with the control group. The values of OD in CCN2 6.25， 12.5， 25， 50， 100 μg/L group were （0.78±0.05）， （0.91±0.03）， （1.23±0.09）， （1.57±0.11）， and （1.61±0.15） respectively， higher than that of the control group （0.51±0.02）， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Furthermore， CCN2 increased alkaline phosphatase activity of hDPSCs， exhibiting a dose-dependent manner， and the values of OD in CCN2 6.25， 12.5， 25， 50， 100 μg/L group were （0.32±0.04）， （0.43±0.04）， （0.61±0.03）， （0.79±0.06） and （0.81±0.07） respectively， compared with the control group （0.19±0.03）， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. The results of Western blot Showed that CCN2 also could induce the expression of odontoblast marker proteins. Conclusion CCN2 can promote the hDPSCs to differentiation into odontoblasts.

[Key words] CCN2； Human dental pulp stem cells； Proliferation； Differentiation

牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）是指存在于成年机体牙髓组织中具有自我更新和多向分化潜能的未分化细胞或前体细胞。当牙本质牙髓复合体受到损伤后，这些细胞可以向受损部位迁移并分化为成牙本质细胞，形成修复性牙本质，实现机体的自我修复和保护，已知多种细胞因子参与这一过程[1]。

CCN家族由一组具有高度序列同源性的多肽因子组成，包括半胱氨酸富集蛋白（cysteine-rich 61，CYR61/CCN1）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF/CCN2）、肾母细胞瘤过度表达蛋白NOV（nephroblastoma overexpressed，NOV/CCN3）以及Wnt-1诱导的分泌蛋白（Wnt-induced secreted proteins-1，WISP-1/CCN4）、WISP-2/CCN5和WISP-3/CCN6）[2]。CCN2是一种由即早基因编码的分泌蛋白，研究表明，CCN2在软骨形成的早期和软骨周围骨化阶段有很强的表达[3]。但目前尚未有文献报道CCN2对DPSCs的影响。本文以人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）为研究对象，研究CCN2对hDPSCs增殖和分化的影响。

1 材料与方法

1.1 牙髓干细胞的分离培养

收集在延安大学附属医院口腔修复科因正畸或阻生而拔除的牙齿，生理盐水冲洗，无菌条件下取出牙髓组织，剪碎，以1∶1的比例加入3 g/L的Ⅰ型胶原酶和4 g/L的Dispase于37℃消化45 min，离心后沉淀物加入细胞培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）培养基（Gibco公司）充分混匀，轻轻吹打离散单细胞团块，将形成的单细胞悬液通过70 μm的细胞筛网，获得单细胞悬液。离心弃上清，用含20%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的DMEM将细胞浓度调整为2×105个/mL，接种于培养瓶中，37℃、5%CO2恒温培养箱静置培养，细胞生长接近融合时传代。

1.2 免疫荧光检测

将第二代hDPSCs接种于96孔板，常规培养24 h后弃培养液，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%细胞裂解液作用20 min，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（Sigma公司）（37℃封闭60 min，去除多余液体，滴加小鼠抗STRO-1一抗（Invitrogen公司）过夜，再加入异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的山羊抗鼠二抗（Invitrogen公司），室温避光半小时后在暗室中用荧光显微镜观察。

1.3 hDPSCs增殖实验

取对数生长期hDPSCs，消化后计数，每孔1×104个，共100 μL，每组3孔，加入不同浓度的CCN2（6.25、12.5、25、50、100 μg/L）（Santa公司），并将其分为CCN2 6.25、12.5、25、50、100 μg/L组；混匀后置于37℃、5%CO2孵箱中培养48 h，并设立不加CCN2的对照组。每孔加入噻唑蓝（MTT）溶液（5 g/L）（Sigma公司）20 μL，继续孵育4 h，弃上清，加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司）以溶解蓝紫色结晶甲瓒，置摇床上震荡20 min，振荡10 min后进行比色测定，酶联免疫检测仪在490 nm波长下读取OD值。每组实验重复3次。

1.4 CCN2对hDPSCs碱性磷酸酶活性测定

取生长良好的hDPSCs，实验分组同1.3，培养14 d后弃孔内液，用0.01 mol/L 磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗2次，每孔加入0.2% Triton-X-100 100 μL，4℃过夜。按照试剂盒说明进行操作。反应终止后，振荡5 min，在酶联免疫检测仪上测定各孔A520 nm值。每组实验重复3次。

1.5 蛋白质印迹检测蛋白的表达

采用蛋白质印迹（Western blot）检测牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）和牙本质基质蛋白（dentin matrix protein-1，DMP-1）的蛋白表达水平，提取细胞中的总蛋白，每个样品取40 μg蛋白进行常规十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），蛋白浓度采用BCA试剂盒测定。经电泳后转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，加5%脱脂奶粉稀释好的一抗加于膜上，室温反应60 min；用TBST缓冲液（0.05 mol/L Tris、0.15 mol/L NaCl、0.05% Tween 200）洗膜10 min×3次；加二抗37℃孵育45 min，TBST缓冲液洗膜10 min×3次，电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）试剂盒检测蛋白的表达。以β-actin作为内参。

1.6 统计学方法

采用SPSS 11.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外培养的hDPSCs形态学观察与鉴定

酶消化法产生单个悬浮牙髓干细胞，接种24 h后部分细胞贴壁（图1A，见封三），3 d后换液，弃去悬浮未贴壁细胞，倒置显微镜下观察贴壁细胞大多数为长梭形的成纤维细胞，其中少数几个细胞增殖迅速，培养14 d后形成细胞克隆，细胞呈集落样生长（图1B，见封三）。

牙髓干细胞表面标志的表达：免疫荧光检测结果显示，STRO-1在牙髓干细胞内阳性表达，呈绿色荧光（图2，见封三）。

2.2 CCN2对hDPSCs增殖的影响

通过MTT法测定各组细胞的OD值，结果如图3所示，CCN2可显著促进hDPSCs的增殖。与对照组OD值（0.51±0.02）比较，CCN2各组对hDPSCs的增殖有明显的促进作用，CCN2 6.25 μg/L组OD值为（0.78±0.05），CCN2 12.5 μg/L组OD值为（0.91±0.03），CCN2 25 μg/L组OD值为（1.23±0.09），CCN2 50 μg/L组OD值为（1.57±0.11），CCN2 100 μg/L组OD值为（1.61±0.15）（P < 0.05或P < 0.01）；而CCN2组100 μg/L对hDPSCs的增殖作用与CCN2 50 μg/L组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。

与对照组比较，*P < 0.05；与对照组比较，#P < 0.01

图3 CCN2对人牙髓干细胞增殖的影响（n=3）

2.3 CCN2对hDPSCs碱性磷酸酶活性的影响

碱性磷酸酶的活性是体外牙髓细胞分化的一个标志，因此，本研究检测了CCN2对hDPSCs碱性磷酸酶活性的影响。结果如图4所示，CCN2的各浓度组细胞培养14 d后，碱性磷酸酶活性均明显高于对照组，并呈剂量依赖关系。CCN2 6.25 μg/L组OD值为（0.32±0.04），CCN2 12.5 μg/L组OD值为（0.43±0.04），CCN2 25 μg/L组OD值为（0.61±0.03），CCN2 50 μg/L组OD值为（0.79±0.06），CCN2 100 μg/L组OD值为（0.81±0.07），与对照组（0.19±0.03）比较，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。其中100 μg/L CCN2对hDPSCs碱性磷酸酶活性的促进作用最为显著。

2.4 CCN2诱导牙本质细胞特异性标志物的表达

hDPSCs经CCN2（100 μg/L）刺激7 d后，提取细胞总蛋白，采用Western blot检测牙DSP和DMP-1的蛋白表达水平。结果如图5所示，hDPSCs经CCN2诱导后，人牙本质细胞特异质标志物DSP和DMP-1的蛋白表达水平显著上升。对照组中DSP的灰度值为（0.97±0.04），DMP-1的灰度值为（0.72±0.02），而CCN2组中DSP的灰度值为（2.87±0.13），DMP-1的灰度值为（1.97±0.11），两组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。

3 讨论

牙髓干细胞具有成体干细胞的一般特性，此外它在一定条件下能够可以分化为成牙本质细胞，这将为牙髓组织再生、牙本质修复以及组织工程牙齿的研究提供理论依据和可靠的细胞来源。本研究表明，CCN2可显著促进hDPSCs的增殖和分化。

牙髓中的干细胞是成牙本质细胞的前体细胞，这些细胞在受到外界刺激时，就会发生增殖、启动成牙本质细胞样细胞分化等一系列过程[4]。有研究报道，多种生长因子能促进牙髓细胞的增殖，如碱性成纤维生长因子、转化生长因子β、胰岛素样生长因子-1等[5]。与文献报道相一致，本研究发现CCN2可显著促进hDPSCs的增殖，表明CCN2在调控DPSCs的增殖过程中起着重要作用。

碱性磷酸酶是参与钙化组织形成、代谢和再生的重要物质，较高的碱性磷酸酶被认为是牙本质前体细胞分化、发生生物矿化的前提条件。分化程度越高，分泌矿化基质的能力越强，则碱性磷酸酶活性越高，因此，碱性磷酸酶活性增强被认为是hDPSCs分化和牙本质形成的早期标志之一[6]。有研究表明，CCN2能增加成骨细胞系Sao-2和Mc3T3-E1Ⅰ型胶原基因的表达、碱性磷酸酶的活性及骨桥蛋白、骨钙蛋白的产生[7]；CCN2在体外还可以促进软骨细胞的分化[3]。本研究结果表明CCN2对hDPSCs碱性磷酸酶的活性有显著的促进作用，提示CCN2在骨化过程中发挥作用，它可增强细胞的矿化能力，促进hDPSCs分化为成牙本质细胞。这与CCN2对成骨细胞、软骨细胞的促分化作用相一致。

在牙齿发育过程中，上皮和间充质之间的相互作用导致外胚间充质的细胞分化为成牙本质细胞，并产生牙本质细胞外基质[8]。牙本质涎磷蛋白是牙本质磷蛋白和牙本质涎蛋白的基因复合体，被多数学者认为是成牙本质细胞的特异性蛋白[9]。本研究结果表明CCN2可诱导牙本质细胞特异性标志物DSP和DMP-1的表达，提示，CCN2促进hDPSCs向成牙本质细胞分化可能是通过启动牙髓细胞核DSP和DMP-1的表达，从而导致hDPSCs向成牙本质细胞分化。

综上所述，CCN2对hDPSCs增殖和分化具有显著的促进作用。本研究仅表明了CCN2对人牙髓干细胞的影响，其具体的作用机制尚不清楚，还需进一步的研究。

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（收稿日期：2014-03-06本文编辑：任念）