青蛤多糖提取的条件优化及其抗肿瘤活性研究

【摘要】目的:通过考察加水量及加酸量对青蛤多糖提取率的影响,确定青蛤多糖提取的最佳工艺,并研究该多糖的抗肿瘤活性。方法:青蛤肉经蒸馏水浸泡后,酸水解法进行处理;苯酚硫酸法测糖含量。通过冷冻干燥得到青蛤多糖干品,采用MTT法考察青蛤多糖对前列腺癌细胞DU-145的增殖抑制影响。结果:每20g青蛤匀浆液,当加水量为100mL,4mol/L盐酸的加入量为120mL时,多糖的提取率最高,每100g匀浆液可提取1.8232g多糖。该糖对前列腺癌细胞具有显著的增殖抑制作用,半数抑制率为4.58mg/mL。结论:采用本方法对青蛤多糖的提取及含量测定操作简易,重现性较好,所提取的青蛤多糖具有抗肿瘤活性。

【关键词】青蛤;多糖;提取工艺;抗肿瘤活性

【中图分类号】R917【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)10-028-2

青蛤(Cyclina sinensis),俗称黑蛤、铁蛤、圆蛤、蛤蜊、牛眼蛤,分类学上隶属软体动物门、瓣鳃纲、帘蛤目、帘蛤科、青蛤属,广泛分布于辽宁、河北、山东、江苏、浙江、福建、广东、广西以及海南岛等地[1]。青蛤蛋白质含量高,脂肪含量较低,而不饱和脂肪酸含量相对较高,并含有多种维生素及微量元素,具有很高的营养及药用价值[2]。中医认为,青蛤具有清热燥湿、软坚散结和镇咳作用[3]。现代研究表明,青蛤壳具有治疗慢性气管炎、淋巴结结核、胃溃疡等多种功能;青蛤肉提取物可以体外抑制人肝癌细胞增殖,增强老龄鼠脾脏内巨噬细胞、淋巴细胞和淋巴结内巨噬细胞的活性,促进免疫细胞应答反应和提高机体免疫力等作用[4]。虽然目前从海洋生物中提取多糖并测定其抗肿瘤活性的文献已有大量报道[5-10],但是有关青蛤活性多糖的抗肿瘤活性研究至今还属空白。本研究采用酸解方法从青蛤组织中提取多糖,考察了料液比和加酸量对多糖提取率的影响,确定从青蛤中提取多糖的最佳条件,并测定该多糖体外对人肿瘤细胞的增殖抑制活性。

1材料

1.1动物与试剂

青蛤购自舟山市场(经浙江海洋学院赵盛龙教授鉴定),去壳后,-20℃冷藏备用;胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司;胰蛋白酶、F12粉末培养基和MTT均购自美国SIGMA公司;二甲基亚砜购自美国AMRESCO公司。其余试剂均为分析纯。

1.2主要仪器

BSA124S型电子天平(德国,Sartorius AG公司);DS-1型高速组织捣碎机(上海标本模型厂);CF16RXII高速冷冻离心机(日立 HITACHI公司);SSW型微电脑电热恒温槽(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);722S可见分光光度计(上海恒平科学仪器有限公司);ZHJH-C1209C型超净工作台(上海智诚分析仪器制造有限公司);Forma 3111型CO2培养箱(美国Thermo公司);倒置显微镜(日本OLYMPUS公司);酶标仪(美国Bio-Rad公司)。

2方法

2.1青蛤多糖提取工艺的优化

2.1.1加水量考察

青蛤肉用组织捣碎机捣碎,匀浆。分取20g三份,加入100mL,200mL,300mL蒸馏水,4℃浸泡24h,纱布过滤,5000r/min离心10min,取上清液,用透析袋将其浓缩定容至20 mL,硫酸-苯酚法测定其糖含量。

2.1.2酸解条件考察

取青蛤肉20g三份,分别加入蒸馏水100mL,浸泡24h,纱布过滤,5000r/min离心10min,取上清液。透析袋浓缩定容至20mL,加入4mol/L盐酸100mL,120mL,140mL,100℃酸解2h,冷却后用10mol/L氢氧化钠调pH约6.8,定容至250mL,5000r/min离心10min,取上清液,硫酸-苯酚法测定其糖含量。

2.2硫酸-苯酚法

精密吸取0.1mL待测溶液,定容至20mL,吸取0.1mL置于具塞试管中,依次加蒸馏水至1mL,另设空白试管加蒸馏水1mL,各加5%苯酚溶液1mL,小心振摇混匀,加入浓硫酸5mL,迅速振摇混匀,于室温下放置30min,在490nm波长处分别测定吸光度,根据标准曲线计算糖含量。

2.3标准曲线绘制

精密吸取1.00mg/mL葡萄糖标准溶液0.1mL,0.2mL,0.3mL,0.4mL,0.5mL,0.6mL,0.7mL,0.8mL置于10ml具塞试管中,依次加蒸馏水至1mL,另设空白试管加蒸馏水1mL,各加5%苯酚溶液1.00mL,小心振摇混匀,加入浓硫酸5mL,迅速振摇混匀,于室温下放置30min,在490nm波长处分别测定吸光度。

2.4重复性实验

取青蛤肉20g三份,分别加入蒸馏水100mL,浸泡24h,纱布过滤,5000r离心10min,取上清液。透析袋浓缩定容至20mL,加入4mol/L盐酸120mL,100℃酸解2h后,冷却用10mol/L氢氧化钠调pH约6.8,定容至250mL,5000r离心10min,取上清液,测定多糖含量和RSD。

2.5细胞培养

选取人前列腺癌细胞DU145(原购自中科院上海细胞库,由本实验室传代保存),用含10%小牛血清的RPMI1640完全培养基于37℃,5% CO2培养箱中培养至对数生长期。

2.6细胞增殖抑制率的测定

采用MTT法进行检测[11]。配制PBS溶液(PH值为7.2)和浓度分别为1.5mg/mL,2.5mg/mL,3.5ml/mL,4.5mg/mL,5.5mg/mL,6.5mg/mL的青蛤多糖溶液。取对数生长期的细胞制成悬液,接种至96孔板,每孔200μL,于5% CO2,37 ℃贴壁4h,然后分别加入不同浓度的青蛤多糖溶液,每个浓度设3个平行孔,同时设不加药对照组,置5% CO2,37 ℃培养箱中孵育48h,培养结束加MTT继续培养4h,吸弃MTT,置酶联免疫检测仪在490nm测吸光度,计算细胞增殖抑制指数(IR),按下列公式计算。

IR=[(对照组A值-药物组A值)/对照组A值]×100%

2.7数据处理

各组实验数据测定均做3个平行实验,结果取其平均值。各组数据之间采用单因素方差分析,用t检验进行组间均数的比较,使用SPSS 13.0进行数据分析。

3结果与分析

3.1最佳工艺

3.1.1加水量

当加水量为100mL、200mL和300mL时,所测定的吸光值为0.5514、0.3167和0.2623,由标准曲线可得相对应的糖含量分别为7.2192mg/L、4.1854mg/L和2.5956mg/L(图1,表1),各组数据间差异性显著(P

图1 硫酸苯酚法标准曲线

表1 青蛤多糖提取条件优化结果(I)

Test No. ratio of material to liquid absorbance value (490nm) sugar content (mg/L)

1 1:5 0.5514 7.2192

2 1:10 0.3617 4.1854

3 1:15 0.2623 2.5956

表2 青蛤多糖提取条件优化结果(II)

Test No. content of acid of 4mol/l(ml) absorbance value (490nm) sugar content (mg/L)

1 100 0.3232 3.5696

2 120 0.5797 7.6718

3 140 0.4801 6.0789

3.1.2酸解条件

当加入盐酸的量为100mL、120mL和140mL时,酸解后所测得的吸光值为0.3232、0.5797和0.4801,由标准曲线可得相对应的糖含量分别是3.5696 mg/L、7.6718mg/L和6.0789mg/L(图1,表2),各组数据差异性均显著(P

3.2重复性实验

3次平行测定,青蛤多糖的平均含量为每100g青蛤组织可得1.8232g多糖,RSD为0.407%(n=3),表明重现性良好。

3.3青蛤多糖对DU145细胞增殖的作用

不同浓度青蛤多糖作用于前列腺癌细胞48h后,癌细胞出现明显的增殖抑制现象,且随着浓度的增加抑制率逐渐增大,当浓度为6.5mg/mL时,抑制率达到67.90%(表3)。

表3 青蛤多糖对前列腺癌细胞的增殖抑制率

Group content(mg/ml) OD (x±s) Inhibit rate(%)

control 0.0 0.471±0.045* ―

1 1.5 0.369±0.022* 21.26

2 2.5 0.327±0.017* 30.57

3 3.5 0.289±0.007* 38.51

4 4.5 0.244±0.009* 48.21

5 5.5 0.187±0.004* 60.23

6 6.5 0.151±0.011* 67.90

* P

4讨论

由于青蛤肉中含有大量的蛋白质、脂肪等成分,对实验结果产生干扰,因此需进行除蛋白等处理。对动物多糖除蛋白、脱脂等去除杂质的方法有酶降解法、碱处理法、酸降解法等[12-14],而多糖含量的测定通常采用滴定分析法、苯酚一硫酸显色法、蒽酮显色法等方法,其中以苯酚一硫酸显色法较为可靠,现被作为测定多糖的首选方法[15]。本研究采用水提和酸解相结合的方法,通过单因素实验确定了青蛤多糖提取的最佳工艺。当料液比为1:5,经盐酸除杂后,糖的提取率最高,经重复性试验再现性很好。在最佳工艺条件下提取的多糖经体外抗肿瘤实验表明,该糖具有显著的抗肿瘤活性,对肿瘤细胞的半数抑制率约为4.6mg/mL,且多糖浓度与增长抑制率呈量效关系。

参考文献

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