三种支气管肺泡灌洗液结核杆菌检测方法在菌阴肺结核诊断中的应用研究

【摘要】 目的 探讨涂片、培养、荧光定量PCR（FQ-PCR）检测支气管肺泡灌洗液（BALF）结核分枝杆菌对菌阴肺结核的诊断价值。方法 对73例菌阴肺结核患者的BALF行涂片、培养、FQ-PCR同步检测。结果 菌阴肺结核患者的BALF涂片、培养、FQ-PCR检查的阳性率分别为21.9%、34.2%和60.3%，FQ-PCR法敏感度高且假阳性低（占2.2%）。结论 BALF涂片和FQ-PCR检测对菌阴肺结核的快速诊断具有重要的临床应用价值，培养仍是目前诊断肺结核的金标准；三种方法结合使用可提高菌阴肺结核的诊断率。

【关键词】 支气管肺泡灌洗液； 荧光定量PCR； 菌阴肺结核

Study on three detection ways of bronchoalveolar lavage fluid TB bacilli in the application of smear-negative pulmonary tuberculosis diagnose ZHANG Yan.Yongzhou People's Hospital in Hunan Province,Yongzhou 425001,China

【Abstract】 Objective To explore the values of smearing,training and PCR in the detection of bronchoalveolar lavage fluid（BALF） lepae when diagnising smear-negative pulmonary tuberculosis.Methods Smearing, training and FQ-PCR on 76 cases of smear-negative pulmonary tuberculosis.Results The positive rate of balf smearing,training and the FQ-PCR were respectively 21.9%,34.2% and 60.3%.Way of FQ-PCR is sensitive and the false positive rate is low （2.2%）.Conclusion Ways of smearing and FQ-PCR have the significant clinical value when diagnosing the smear-negative pulmonary tuberculosis in the first time and smearing is still the best one.Therefore,the combination of the three ways can greatly improve the diagnosis of smear-negative pulomary tuberculosis.

【Key words】 BALF FQ-PCR Smear-negative pulmonary tuberculosis

结核菌分离培养是确诊结核的“金标准”。菌阴肺结核（涂片、培养均阴性）约占全部肺结核的40%～60%［1］，若其诊断缺乏“金标准”，易造成临床误诊或漏诊。本文通过对73例菌阴肺结核患者及45例非肺结核患者行支气管镜检查留取支气管肺泡灌洗液（BALF），采用涂片、培养、荧光定量PCR（FQ-PCR）检测结核分支杆菌（MTB），探讨三种方法对菌阴肺结核患者的临床应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究对象均为2009年6月～2010年12月笔者所在医院住院患者。初治菌阴肺结核患者73例，其中男43例，女30例，年龄16～73岁,平均（37.2±9.8）岁。病程1 d～3年不等。非结核患者45例,包括肺癌、支气管扩张、大叶性肺炎、间质性肺炎。所有患者支气管镜检查前痰涂片找抗酸杆菌≥3次阴性，1次培养阴性，临床诊断为肺结核。

1.2 方法

1.2.1 标本的收集和处理 采用日本产OlympusBF-260型电子支气管镜，按支气管镜检查技术常规进行术前准备。所有病例按病变部位选择灌洗肺段,将纤维支气管镜顶端严密插入肺段或肺亚段支气管开口处,先经活检孔注入2%的利多卡因2～3 ml做灌洗肺段的局部麻醉, 然后注入37 ℃的生理盐水5～10 ml，立即用专用的回收装置吸引回收BALF, 可重复灌洗2～3次, 收集BALF约15 ml。

1.2.2 实验室方法 对收集的BALF标本同时送检以下3种检测方法：（1）涂片找抗酸杆菌：按照中国防痨协会“结核病诊断实验室检验规程”操作,用萋-尼氏染色抗酸染色法，≥3条抗酸杆菌/300视野为阳性。（2）结核菌培养：用BacT/Alert3D全自动分枝杆菌快速培养仪器系统（3D系统）进行临床标本的分离培养。（3）应用荧光定量PCR（FQ-PCR）：检测BALF结核分枝杆菌DNA，DNA基因拷贝数量＞1×103拷贝/ml为阳性。

1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件包对数据进行处理，用卡方检验比较不同检测方法诊断肺结核的阳性率。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

73例菌阴肺结核患者BALF分别用涂片、培养、FQ-PCR法检查的结果见表1。

3 讨论

肺结核患者由于化疗、免疫功能障碍，结核杆菌的某些生物学特性发生变异，痰菌含量少或呈L型结核菌、肺部病灶局限未与引流支气管相通等因素，均可致使痰涂片检查阴性［2］。支气管镜检查作为一种辅助诊断肺结核的重要手段，可能获得细菌学的依据，在临床已广泛开展。本研究中支气管肺泡灌洗液直接取材于病灶处支气管肺泡内,细菌浓度高,获得结核分枝杆菌的机会增多［3］，污染几率低,且无痰患者也可以检测。73例菌阴肺结核患者BALF涂片阳性率为21.9%，表明对于菌阴肺结核的实验室诊断，抗酸染色涂片仍具有较好的实用价值。该组冲洗液培养结果阳性率为34.2%，反映出结核分枝杆菌培养这种传统方法对于菌阴肺结核的阳性检出率明显高于涂片法（P＜0.05）。结核杆菌培养仍是目前诊断肺结核的金标准，尤其是进一步可行菌型鉴定和药敏实验，在指导临床用药等方面具有重要作用，这是其他方法无法比拟的。菌阴的患者,FQ-PCR 检测可为阳性,本组FQ-PCR法检测73例菌阴肺结核患者BALF中的TB-DNA, 阳性率为60.3%,显著高于痰涂片阳性率及痰培养阳性率（P＜0.05）；而非肺结核组假阳性率只有2.2%，说明FQ-PCR法检测特异性很高。表明FQ-PCR法能明显提高痰涂片及培养阴性的肺结核患者的结核分枝杆菌检出率,为菌阴肺结核的诊断提供依据。若涂片阳性,而FQ-PCR阴性,首先考虑为非结核分枝杆菌的感染,其次考虑操作原因导致PCR结果的假阴性［4］。

涂片抗酸染色检查是结核病实验室最基本的细菌学检查方法。其优点是简便、快速和价廉；缺点是敏感性低、特异性差,无法辨别死菌与活菌。通常需5000～10000条菌/ml才能得到阳性结果,而且各种抗酸杆菌均可着色,需进一步试验才可确定是否为结核分枝杆菌。细菌培养法的优点是灵敏度高于涂片,并可鉴定死菌与活菌,被誉为结核病诊断的黄金标准。其缺点是需时太久,通常4～8周才能获得结果,快速培养也要2周，而且非结核分枝杆菌也可生长,需进行菌种鉴定方可确定是否为结核分枝杆菌［5］。FQ-PCR技术把核酸扩增、杂交及光谱技术结合在一起,在封闭状态下检测,避免了常规PCR因污染而致的假阳性,利用特异性探针,实时检测,与自动分析一体化,实现精确、特异、简便、快速的检测。FQ-PCR法能稳定检测10copies结核杆菌基因组DNA, 灵敏度高。大量研究表明［4,6,7］，活动性肺结核患者痰FQ-PCR检测阳性率显著高于痰涂片及培养。

本研究结果表明BALF涂片和荧光定量PCR检测对菌阴肺结核的快速诊断具有重要的临床应用价值，培养仍然是目前诊断肺结核的金标准，并可指导临床用药。三种方法在不同情况下结合使用可提高菌阴肺结核的诊断率。

参 考 文 献

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［4］ 张晶,邓群益,高扬,等.实时荧光定量聚合酶链反应检测支气管肺泡灌洗液中结核分枝杆菌-DNA对肺结核的诊断价值.临床肺科杂志,2009,14（3）:336-337.

［5］ 张翊,卢建平,叶淼.四种结核分枝杆菌检测方法的临床应用评价.中国防痨杂志,2006,28（1）:14-17.

［6］ 邵俊斌,王占坤,陈智,等.实时荧光定量聚合酶链反应检测痰结核分枝杆菌DNA 及其临床应用.中华结核和呼吸杂志,2003,26（8）:490.

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（收稿日期：2011-04-08）