HIV-1重组毒株gag区快速基因分型方法

【关键词】 人类免疫缺陷病毒1型；基因型；聚合酶链反应

摘要： 目的 建立一种简便、快速基因分型方法，对广西人类免疫缺陷病毒（HIV-1）重组毒株gag基因区进行亚型鉴定。方法 从HIV阳性样本中提取核酸，使用HIV-1 M组通用引物对gag区进行第1轮扩增，第2轮使用分别检测C亚型和CRF01-AE重组型的二套特异性引物放入同一反应管中进行扩增，根据不同亚型扩增的目的带位置不同判断亚型。另外设计了一套引物，专门用于检测B'/C重组毒株。扩增出的所有样本均进行基因测序和系统树分析以验证结果。结果 54份样本中，经基因测序和系统树分析证实CRF08-BC样本4份（741%), CRF01-AE样本46份（8518%), 4份（741）无法确定亚型。经亚型特异性引物PCR法检测出4份（100%) B'/C重组毒株，45份（9783%) CRF01-AE重组毒株，灵敏度为98%，特异性为100%。2种方法检测结果经差异性检验显示，P>005，差异无统计学意义，结果一致性高达9815%。与基因分析结果吻合。重复实验显示，B'/C的平均重复性为100% (20/20),CRF01-AE为983% (59/60)。结论 该方法具有简便、快速，高度灵敏度和特异性的特点，可直接对广西HIV -1重组毒株CRFO 1-AE gag基因区进行分型。

关键词：人类免疫缺陷病毒1型；基因型；聚合酶链反应

Rapid identification for gag region of circulating recombinant form of humanimmunodeficiency virus type 1

Abstract： Objective To develope a simple and rapid subtype-screening assay for the gag region of the circulating recombinant form (CRF) of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1）in Guangxi.Methods Proviral DNA from HIV-positive samples were extracted and subjected to the first round PCR with universal primers for the gag region that can detect HIV-1 M group isolates.In the second round PCR,two pairs of subtype-specific primers that were designed to detect subtype C and CRF01-AE respectively were added into one tube.The PCR products of different subtypes could be distinguished in agarose-gel electrophoresis.Another pair of subtype-specific primers exclusively detecting the the prevalent recombinantstrains CRF07-BC and CRF08-BC was designed and used.Additionally,all of these samples were sequenced and analyzed phylogenetically.Results DNA sequencing and phylogenetic analysis of the gag region of the 54 samples showed that 4 samples (7.41%) were infected with CRF08-BC,46 (85.18%) with CRF01-AE and 4 (7.41%) remained unclassifiable.Detection of the subtype-specific primer sets revealed that 4 were B'/C (100%),and 45 were CRF01-AE (97.83%),with an adequate sensitivity (98%) and a high specificity (100%).Non-specific bands occasionally appeared but did not interfere with interpretation of the results.The phylogenetic analysis was consistent with subtype-specific primer sets and the consistent rate was 98.15%.The average reproducibility was 100% for B'/C samples and 98.3% for CRF01-AE samples.Conclusion A simple,rapid and low cost assay is developed for subtype-screening of CRFO1-AE in Guangxi.For the B'/C strains in Guangxi,it needs to be verified further by increasing samples.

Key words： human immunodeficiency virus type 1(HIV-1）；genetic subtype；polymerase chain reaction (PCR)

人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）高度变异，不同亚型毒株其生物学特性及；分子流行病学特征均有所不同〔1〕，若能快速、准确地对HIV进行基因分型不仅有助于了解HIV-1转播规律，而且可为阐明HIV基因型与生物表型关系、药物耐药性等研究提供资料。近年来，我国学者〔2〕建立了一种多重巢式PCR法对我国HIV-1主要流行株进行鉴定亚型。然而，由于HIV-1的基因变异度极高，在传播过程中可产生许多具有相对独立的基因序列型别，使得不同地区各亚型间具有其自身的特异性。广西壮族自治区为国内HIV感染的高发区，大部分感染发生在经济尚不发达地区的人群中。因此，建立广西HIV-1主要流行株快速基因分型方法十分必要。目前，广西的优势流行株为CRF01-AE和CRF08-BC重组毒株〔3,4〕。为此，本研究针对这2种重组毒株gag基因区建立了一种亚型特异性引物PCR法的快速基因分型法。

1 材料与方法

11 样本来源 从广西HIV-I主要流行区采集54份样本，经ELISA初筛和免疫蛋白印迹（WB）确认为HIV阳性样本。

12 核酸提取 采用QIAamp Bloodes Mini Kit试剂盒（德国QiaGen公司）从每位感染者的抗凝全血中提取细胞DNA，并冻存于-80℃冰柜备用。

13 HIV-1亚型特异性引物的设计 亚型特异性引物的设计是整个方法建立的关键。设计的基本原则：设计的引物位点必须在各个亚型间高度特异，而在同一种亚型内部高度保守。在Primer50软件的帮助下设计出gag区的亚型特异性引物（表1)。

14 HIV-1 gag基因区的扩增 用nested-PCR对HIV-1 gag基因区进行扩增，第1轮使用引物GagF2/Gage2，模板15μl，反应条件：94℃ 5min,52℃ 1min,72℃ 2min 30s,1个循环；94℃ 30s,52℃ 30s,72℃ 1min 30s,30个循环；72℃ 10min。第2轮模板5μl，使用分别检测C亚型和CRF01-AE重组型的2套亚型特异性引物（Cag-c1/Cag-c2,Cag-ae1/Cag-ae2) ,争套引物放入同一反应管中，为减少非特异性反应，使用热启动和降落PCR (TD-PCR）技术〔5〕，94℃ 5min，52℃ 1min,72℃ 2min 30s,1个循环；94℃ 30s,52℃ 30s,72℃ 1min,3个循环；94℃ 30s,51℃ 30s,72℃ 1min,3个循环；94℃ 30s,50℃ 30s,72℃ 1min,3个循环；94℃ 30s,49℃ 30s,72℃ 1min,3个循环；94℃ 30s,48℃ 30s,72℃ 1min,25个循环，72℃ 10min。如果特异性引物PCR扩增出的目的条带判断为C亚型，则用专门用于检测B'/C重组毒株（包括CRF07-BC和CRF08-BC）的亚型特异性引物Cgag-c1/Cgag-bc为内侧引物再进行PCR扩增，以判断是否为重组形式。反应条件：94℃ 2min,48℃ 1min,72℃ 2min,1个循环；94℃ 30s,48℃ 30s,72℃ 1min,35个循环；72℃ 10min。同时使用引物306/Cn-gag扩增所有样本并进行基因测序，用于系统树分析及亚型鉴定以验证特异性引物分型结果是否正确。反应条件：94℃ 2min,50℃ 50s,72℃ 1min,1个循环；94℃ 30s, 50℃ 30s, 72℃ 1min,35个循环；72℃ 10min。第1轮和第2轮PCR反应体系均为50μl,dNT/P浓度为200μmol/L,Taq酶为25U，引物浓度为04μmol/L,MgCl2浓度为15mmol/L。表1 gag区PCR扩增使用的引物 （略）内侧特异性引物注：R=A或G

15 PCR产物检测 取5μl第2轮PCR扩增产物在2％琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭（EB）染色检测，紫外摄影拍照，根据Markers分子量大小来判定结果。C亚型片段190bp;CRF01-AE片段881bp;B' /C片段1079bp。

16 序列测定 对于全部经引物306/Cn-gag扩增的样本，经切胶，纯化后，以306为测序引物，提纯的PCR产物为模板，采用DNA测序试剂盒（美国ABI公司）,在PTC-220型多通道PCR仪（美国MJ公司）上进行测序反应。反应产物经提纯后，采用310型全自动毛细管DNA测序仪（美国ABI公司）进行序列测定和分析。

17 序列分析 （美国Los Alamos国家实验室HIV核酸序列库中提供）基因分型工具BLAST程序进行基因型鉴定；用Clustal X进行排序和MEGA version 21软件进行分析。亚型分析使用的各个亚型参考序列来自美国Los Alamos HIV基因数据库。

18 检测该方法的重复性 在CRF01-AE样本中随机选取12份，CRF08-BC 4份，共16份样本使用上述方法重复5次。

2 结果

21 样本基因测序和系统树分析 54份阳性样本中通过引物306/Cn-gag扩增最终获得50份样本的基因序列，经BLAST程序鉴定出4份样本gxmu0402,gxmu0416、gxmu0418和gxmu0419为CRF08-BC重组毒株，余下46份为CRF01-AE重组毒株。将50份基因序列与国际各亚型标准株的基因序列进行系统树分析显示。4份CRF08-BC样本与CRF08-BC98CN006和CRF08-BC97CNGX7f靠得很近，而46份CRF01-AE中，有44份与CRF01-AE97CNGX2f聚成一簇，另外2份样本gxmu0432和gxmu0439与CRF01-AE93JPNH 1和CRF01-AE93TH057十分接近。

22 亚型特异性引物PCR扩增 部分样本经亚型特异性引物PCR扩增后的电泳结果见图1和图2。根据不同亚型扩增出的目的带位点不同，判断出亚型结果。54份样本中，采用特异性引物共扩增出49份样本，其中C亚型4份，CRF01-AE重组毒株45份（9783%,45/46)。进一步使用B'/C重组特异性引物扩增C亚型特异性引物鉴定出来的4份样本，发现这4分样本均为B'/C重组毒株（100%,4/4)。以基因测序法为金标准，可知亚型特异性引物PCR法的灵敏度为98%，特异性为100%。

23 亚型特异性引物PCR法的重复性 重复实验采用4份CRF08-BC样本和12份CRF01-AE随机样本进行5次重复。结果显示，CRF08-BC重组毒株平均重复性为100%（20/20），而CRF01-AE在5次重复中有1次出现1份样本检测不出，其平均重复性为983%（59/60）。M：DNA分子量；1：H2O；2：阴性对照；3：xmu0433;4:gxmu0440;5:gxmu0451;6:gxmu0462图1 部分CRF01-AE样本琼脂糖电泳结果（略） M：DNA分子量；1：H2O；2：阴性对照；3:gxmu0418;4:gxmu0419　图2 B'/C样本琼脂糖电泳结果

24 基因测序法与亚型特异性引物PCR法比较 54份己确认的阳性样本，基因测序法检测并正确分型的样本是50份，检出率为9260%，特异性引物PCR法为49份，检出率为9074%。2种方法检测结果经差异性检验显示，χ2=0,P>005，差异无统计学意义，结果一致性高达9815%。

3 讨论

本研究结果表明，亚型特异性引物PCR方法对于亚型的鉴定结果与基因测序、系统树分析得到的结果是吻合的，该方法的特异性达100%。用亚型特异性引物扩增样本时，有时一会出现非特异性扩增条带，干扰实验结果。非特异性条带位置一般不在特异性位置。为防止误判，可以通过跑厚胶并且延长电泳时间，使目的条带与非特异性条带充分分开。通常在紫外灯下，非特异性条带要比目的条带弱。出现非特异性扩增条带通常有如下的原因：(1)引物与模板错配扩增产生，引物与模板亚型相符，不仅能在特异性位点上与模板结合，亦能在远离特异性位点的地方与模板结合，这种情况错配通常靠近引物5′端的位置，电泳时会出现两条带；(2)引物之间形成的引物二聚体，一般出现在80bp左右的位置，通过长时间电泳可使此条带消失；(3)某一亚型的特异性引物与另一亚型的模板错配扩增产生，因2套引物放入同一反应管中，所以可能出现此情况，为了避免此情况发生，因此，在设计引物时使引物在3′端与别亚型的模板至少有2个碱基产生错配。用本研究所建立起的方法对54份样本的gag基因区进行检测，发现有些样本在1200bp左右的位置会出现一条非特异性扩增，因第1轮PCR扩增的条带位置在1242bp,因此怀疑此非特异性扩增条带为第1轮PCR扩增出的目的带，将第1轮PCR产物与用亚型特异性引物扩增出的第2轮产物同时进行电泳，证实了这一推测。为了减少此情况的发生，可减少第1轮反应的模板量，同时在加入反应体系、模板和酶后尽量减少室温放置时间或在冰盒上操作。本实验结果表明，亚型特异性引物PCR法，灵敏度为98%，特异性为100%，结果显示，其灵敏度和特异性均较好。重复性实验显示，B'/C亚型的平均重复性为100%,CRF01-AE重组毒株为983%,说明一该方法在实际中是可行的。但由于CRF08-BC样本例数不多，因此，本研究所建立起的方法对于HIV-1 B'/C重组毒株分型的准确性有待扩大样本量进一步证实。

参考文献

〔1〕 杰伊A，利维.艾滋病病毒与艾滋病的发病机制［J］.2版.北京：科学出版社，2000：126-132.

〔2〕 Wei M,Guang Q,Liang H,et al.Simple subtyping assay for human immunodeficiency virus type 1 subtypes B,C,CRF01-AE,CRF07-BC,and CRF08-BC［J］.J Clin Microbiol,2004,42:4261-4267.

〔3〕 Yang R,Kusagawa S,Zhang C,et al.Identification and characterization of a new class of human immunodeficiency virus type 1 recombinants comprised of two circulating recombinant forms,CRF07-BC and CRF08-BC,in China［J］.J Virol,2003,77:685-695.

〔4〕 Piyasirisilp S,McCutchan FE,Carr JK,et al.A recent outbreak of human immunodeficiency virus type 1 infection is Southern China was initiated by two highly homogeneous,geographically separated strains,circulating recombinant form AE and a novel BC recombinant［J］.J Virol,2000,74:11286-11295.

〔5〕 迪芬巴赫CW，德维克斯勒GS著，黄培堂，俞炜源，陈添弥，等译.PCR技术实验指南［J］.北京：科学出版社，1998：33-40.