蒲地蓝消炎片微生物限度检查方法的验证

[摘要] 目的:建立蒲地蓝消炎片微生物限度检查的方法。方法:参照《中国药典》2005版,采用5种阳性对照菌回收率试验测定其是否含抑菌成分。结果:按供试品制备方法,各试验菌样品中的回收率均大于70%。结论:采用培养基稀释法可消除药品的抑菌作用,可有效地检出污染的微生物,使测定结果准确,药品质量安全有效,可用于该药品的微生物限度检查。

[关键词] 蒲地蓝消炎片;微生物限度检查;培养基稀释法;验证

[中图分类号]R927 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2009)08(a)-076-02

Validation of methods in microbial limit tests for Pudilan Xiaoyan Tablets

XIE Yanli

(The First People's Hospital of Pinjiang, Hu'nan Province, Pinjiang 414500, China)

[Abstract] Objective: To establish a method of microbial limit tests for Pudilan Xiaoyan Tablets. Methods: According to China Pharmacopoeia edition 2005, 5 positive control trains were carried out to determine the recovery rate of antimicrobial effect. Results: According to the results, the recovery rates of sample were over 70%. Conclusion: Pudilan Xiaoyan Tablets preparations can eliminate the bacteriostatic action with accurate result and reach the objective,and it can be used in the microbial limit tests.

[Key words] Pudilan Xiaoyan Tablets; Microbial limit tests; Dilution method; Validation

蒲地蓝消炎片由黄芩、蒲公英、苦地丁、板蓝根四味中药组成,其中三味药通过提取或煎煮制成浓缩膏,与适量黄芩粉末及辅料,混匀,制粒,干燥,压制成片,包衣即得。其具有清热解毒、抗炎消肿的功效,用于疖肿、咽炎、扁桃腺炎的治疗。进行微生物限度检查时,必须根据《中国药典》规定的方法消除供试液抑菌活性后再进行检查[1]。考虑蒲地蓝消炎片处方中的药物具有抑菌成分,为确认所采用的方法是否适合该药品的细菌、真菌、酵母菌数及控制菌(大肠埃希菌、大肠菌群)的测定,本文对其进行了微生物限度检验方法验证试验,现报道如下:

1 仪器与材料

1.1 样品

蒲地蓝消炎片(山东仙河药业有限公司,批号为070403、080701、080803)。

1.2 培养基

营养琼脂培养基(批号为050228);改良马丁琼脂培养基(批号为070822);玫瑰红钠琼脂培养基(批号为050531);胆盐乳糖培养基(批号为0504192);营养肉汤(批号为050508);改良马丁培养基(批号为040302)等,均由中国药品生物制品检定所监制,北京三牛科技开发公司生产。

1.3 菌种

枯草芽胞杆菌[CM CC(B)63501]、大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉菌[CMCC(F)98003],均由中国生物制品检验所提供。

1.4 仪器

净化工作台,LhS-250SC恒温恒湿培养箱、LhR-250生化培养箱(上海一恒科技有限公司);hTY2000A型集菌仪,hTY反复使用集菌培养器(杭州高得医疗器械有限公司及杭州泰林生物术设备有限公司);三雄牌YJ-A电动匀浆仪等。

1.5 稀释剂

0.9%无菌氯化钠溶液,pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液。其中,氯化钠(分析纯)由上海化学试剂厂生产;pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨(批号为061026),由北京三牛科技开发公司生产。

2 方法与结果

2.1 试验方法

参照《中国药典》2005版一部[2]微生物限度检查方法进行试验。

2.1.1 菌液的制备[3]①取经35～37℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌的营养肉汤培养物1 ml,用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-7,使成50～100 cfu/ml,经活菌计数后备用。②取经25～28℃培养18～24 h的白色念珠菌的改良马丁培养物1 ml,用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5～10-6,使成50～100 cfu/ml,经活菌计数后备用。③取经25～28℃培养1周的黑曲霉的改良马丁琼脂斜面培养物,用0.9%无菌氯化钠溶液5 ml洗下黑曲霉孢子,吸出孢子悬液1 ml,加0.9%无菌氯化钠溶液适量,稀释至与标准比浊管浊度相当的孢子悬液,取此孢子悬液1 ml,用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-4,使成50～100 cfu/ml,经活菌计数后备用。上述各菌株的培养物均为第四代培养物。见表1。

2.1.2 供试液的制备[3]分别称取样品10 g,加45℃、pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml,混匀,得1∶10的供试液。

2.2 细菌、真菌及酵母菌方法验证

2.2.1 常规法采用供试液l ml/皿。

2.2.2 培养基稀释法采用供试液0.5 ml/皿(1∶400稀释),0.2 ml/皿(1∶1 000稀释)。

2.2.3 回收率测定

2.2.3.1 试验组:取上述方法制备的供试液,置平皿中,分别人工污染上述5种试验菌株50～100 cfu/ml,立即倾注15～20 ml规定的琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养24～72 h,逐日观察结果,平板计数,测定回收率。

2.2.3.2 菌液组:测定加入的菌数。

2.2.3.3 供试品对照组:取规定量的供试液,按菌落计数方法,测定供试品菌数。

2.2.3.4 计算:试验组的菌回收率(%)=(试验组的平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%。

2.3 结果

2.3.1 常规法测定蒲地蓝消炎片的回收率,结果见表2。

表 2 常规法测定回收率试验均值(cfu/ml)

从表2结果可以看出,采用常规法测定,人工污染5株代表菌,该供试品对枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌无明显抑菌作用,回收率在70%以上;但该供试品对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌有抑菌作用,回收率在70%以下,不能采用常规法测定。

2.3.2 培养基稀释法测定蒲地蓝消炎片的回收率试验,结果见表3。

表 3 培养基稀释法测定回收率试验均值(cfu/ml)

从表3结果可以看出,该样品采用培养基稀释法测定,金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均在70%以上,可采用培养基稀释法测定。

2.4 控制菌(大肠埃希菌、大肠菌群)的检查法验证

供试品为含生药粉的口服药,按照《中国药典》2005版微生物限度检查法的规定,需验证大肠埃希菌和大肠菌群,选择金黄色葡萄球菌作为阴性对照菌。

2.4.1 大肠埃希菌验证试验分为两组,试验组:取1∶10供试液10 ml,加入大肠埃希菌备用液1 ml,接种至100 ml胆盐乳糖培养基中,于35～37℃培养18～24 h,按照《中国药典》2005版微生物限度检查法进行检查;阴性菌对照组:取金黄色葡萄球菌菌悬液1 ml和10 ml的1∶10稀释级供试液,接种至100 ml的胆盐乳糖培养基中,35～37℃培养18～24 h,依大肠埃希菌检查法进行检查。

2.4.2 大肠菌群验证试验分为两组,试验组:取含10 ml胆盐乳糖发酵培养基管1支,加入1∶10供试液1 ml和大肠埃希菌备用液1 ml,于35～37℃培养18～24 h,按照《中国药典》2005版微生物限度检查法进行检查;阴性菌对照组:取金黄色葡萄球菌菌悬液1 ml和1∶10供试液1 ml,接种至100 ml的胆盐乳糖发酵管中,35～37℃培养18～24 h,依大肠埃希菌检查法进行检查。

2.4.3 结果大肠埃希菌组中试验组在培养18 h内检出大肠埃希菌,阴性菌对照组48 h内未检出金黄色葡萄球菌;大肠菌群组中试验组检出大肠菌群,阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌。故可照上述供试液制备法进行蒲地蓝消炎片的控制菌检查。

3 讨论

为考察供试液制备过程中微生物受影响的程度,采用相应的稀释液代替供试品[4],加入试验菌作为对照组,按供试品组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌落数,结果菌回收率达到90%以上。

由于本品为复合制剂,其中任何具有抑菌作用的成分均可影响微生物限度检查的准确性[5]。实验结果表明,蒲地蓝消炎片对枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌及控制菌无抑制作用,对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌有抑制作用,采用培养基稀释法可以稀释本品中的抑菌成分,从而消除其对细菌和真菌生长的影响。故采用培养基稀释法进行细菌、真菌及酵母菌检查,采用常规法检查蒲地蓝消炎片控制菌。

[参考文献]

[1]马越,特玉香,杜平华,等.16种中成药微生物限度检查法方法验证[J].中国药品标准,2005,6(6):12-15.

[2]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:化学工业出版社,2005:附录70-79.

[3]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国科学技术出版社,2005:4.

[4]高捷.复方甘草口服溶液微生物限度检查法验证实验[J].中国医药导报,2008,19(5):30-31.

[5]赵建英,李爱玲,陆蓓.含黄芩中药成分微生物限度检查方法的验证[J].中国药业,2004,13(11):44-45.

(收稿日期:2009-05-06)