时间：2022-10-14 09:58:42
摘要：目的：优化大孔吸附树脂分离纯化荷叶中荷叶碱的洗脱条件。方法：用D101大孔吸附树脂进行分离纯化，20%～70%的乙醇梯度洗脱，并采用HPLC对其中的荷叶碱进行含量测定。结果：采用50%～70%的醇梯度洗脱后荷叶碱的总收率达1.3%。结论：此方法操作简单，重复性好，用50%～70%的乙醇进行梯度洗脱，能有效的提纯、富集荷叶中的荷叶碱。
关键词：荷叶碱；D101大孔吸附树脂；梯度洗脱；含量测定
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)04-0877-03
荷叶为睡莲科植物莲（Nelumbl nuciferea Gaertn）的叶，具有清热解暑、升发清阳、凉血止血之功。《本草纲目》载“荷叶服之，令人瘦劣”，现代临床广泛应用于肥胖症及高血脂症[1]。荷叶碱是荷叶中的一种阿朴啡类生物碱，药理作用研究表明荷叶碱为荷叶中的主要降脂活性成分[2-3]。荷叶碱的需求量在不断的增加，但是目前缺少方便有效的制备较纯荷叶碱的方法，限制了对荷叶资源进一步的开发和利用。本实验采用70%的乙醇提取，大孔吸附树脂分离纯化，高效液相对其进行含量测定，为荷叶的开发提供理论依据。
1实验材料
FA1004上皿电子天平（上海天平仪器厂）,SHZ-3（Ⅲ）型循环水多用真空泵（河南省予华仪器有限公司）,旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）,真空干燥箱（天津天宇仪器有限公司）,高效液相色谱仪Waters 515（上海Waters公司）,荷叶碱标准品（购于中国药品生物制品检定所）,D101大孔吸附树脂（天津海光化工有限公司）,HPD―100 大孔吸附树脂(河北沧州宝恩化工有限公司) 。
2荷叶总生物碱的提取与纯化
2.1药材的含量测定由于从不同药房购买的荷叶的质量不同，其荷叶碱的含量也不一样，所以为了取得最佳试验效果，本试验在实验前先对荷叶进行了筛选。通过HPLC测定了不同批荷叶中荷叶碱的含量，具体测定方法见2005版《中国药典》上的方法[4],测定结果，见表1，由表中测得的结果可知B荷叶可作为本试验用荷叶。
2.2荷叶生物碱的提取称取碱荷叶，切成细丝，加70%的乙醇30倍量，浸泡30min，回流提取两次，每次2h,过滤，回收乙醇，抽滤，置蒸发皿中，水浴挥至无醇味处备用。
2.3树脂的预处理及树脂柱的净化大孔吸附树脂D101和HPD-100，先用95%的乙醇浸泡24h，装柱后先用95%乙醇洗至无浑浊，再用蒸馏水洗，洗至无醇味后备用。净品树脂D101则可用蒸馏水浸泡后直接装柱使用。
2.4树脂的筛选用HPD-100[5]和D101大孔树脂作比较，其相同条件下平行实验测得的结果。见表2，本实验表明选择用D101大孔吸附树脂纯化较好。
2.5洗脱剂的选择前期实验以紫外为检测方法表明[6]，用梯度洗脱比用单一浓度溶剂洗脱效果好，荷叶碱的回收率较高，所以采用20%～70%的乙醇梯度洗脱。
2.6荷叶总生物碱的分离纯化荷叶总生物碱的分离纯化，用净品树脂D101处理后装柱使用。将制备好的荷叶生物碱溶液与中性氧化铝拌干后加入，调整树脂柱流速≤1d/s。水-乙醇梯度洗脱，直到洗脱液中检测无生物碱（检测终点：加碘化铋钾无桔红色沉淀，加硅钨酸无灰白色沉淀）浓缩成稠膏，然后50℃减压干燥,即得总生物碱。
3荷叶碱的含量测定
3.1色谱条件色谱柱，Symmetry-18(4.6mm×250mm);流动相，乙腈∶水∶三乙胺∶冰醋酸（27∶70.6∶1.6∶0.78）；流速，1mL/min；检测波长：270nm；柱温：25℃。
3.2溶液制备对照品溶液：精密称取荷叶对照品1.35mg置10mL量瓶中，用甲醇溶解，定容至刻度，再精密吸取1.0mL置10mL量瓶，甲醇定容至刻度，配制成浓度为13.5μg/mL的溶液。供试品溶液：将生物碱粉末精密称取适量，置25mL的容量瓶中，用流动相溶解，超生助溶,充分溶解后，微孔滤膜滤过，备用。
3.3线性关系的考察精密吸取荷叶碱对照品溶液（0.135mg/mL）0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL分别置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件，分别精密吸取20μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品的浓度（μg/mL）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：Y=5.26×104X+3.58×104，r=0.9992。表明荷叶碱在6.75～33.75μg/mL范围内具有良好的线性关系。
3.4精密度考察精密吸取对照品溶液（13.5μg/mL）20μL，重复进样5次，荷叶碱峰面积的平均值为7605852,RSD=0.89%。
3.5稳定性考察取同一供试品溶液，分别于配制后0、2、4、6、8、10h；依法测定，结果表明供试品溶液在此期间内基本稳定，测量结果均无明显变化，荷叶碱峰面积平均值为920431，含量的RSD=1.2%。
3.6荷叶碱总收率的含量测定见表3。
3.7不同浓度的醇梯度洗脱的各个流份中荷叶碱的含量测定由于不同浓度乙醇溶液对荷叶中生物碱的洗脱能力不同，采用20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇溶液进行梯度洗脱，荷叶中荷叶碱得到了分离富集。荷叶碱主要富集在50%～70%的醇洗脱液中，其中70%的洗脱液中含量最高。各洗脱液分别蒸干后得到固体，荷叶碱在相应固体中的质量分数分别为：0.753%、2.411%、3.313%。见图1～图7。
4讨论
树脂型号的影响：本实验在分离纯化过程中，用HPD-100大孔吸附树脂 [5]和D101大孔树脂做了比较，发现前者效果远不如后者，故本实验选择用D101大孔吸附树脂纯化。出现这种情况可能由于实验条件不同或者是处理方法不同引起的，具体原因需进一步研究。
本实验考虑其总回收率，将不同浓度的洗脱液都收集到了一起。发现荷叶碱回收率可由原来单用50%乙醇洗脱时的收率0.753%提高到梯度洗脱后的1.3%。因此梯度洗脱可作为一种提高荷叶碱回收率的较好方法。
本实验在含量测定过程中，曾经用甲醇配制供试品溶液，测得荷叶碱的含量都很低，后来改用流动相去溶解提取分离的干燥物，测量结果有了明显的改善。因此，笔者建议在用高效液相进行荷叶碱含量测定时，供试品溶液最好用流动相配制，以提高测量的准确性。
5结论
本实验结果表明：用70%乙醇提取荷叶中的荷叶碱提取比较完全，用D101大孔吸附树脂进行分离纯化，50%～70%的乙醇进行梯度洗脱，能有效分离富集荷叶中的荷叶碱，该方法操作简便、重复性好。
参考文献
［1］TaoB,Chen M Y ,Li XN,et al.Review in studies on pharmacological effect of Nelumbo nuciferine leaves [J].Inf Tradit Chin Med，2001，18（2）：14
［2］Tu C C,Li X Y,Yang J P,et al.experiment research of the total alkaloids from Nelumbo nuciferine leaves effect on lowering hyperlipemia in fatty mice[J].jiangxi college Tradit Chin Med，2001，13（13）：120-121.
[3]Xu L Y,Liu Y G,Ye Z X,et al.Development and research of effect on lowering hyperlipemia of Nelumbo nuciferine leaves [J].Hubei J Tradit Chin Med，1996，18（1）：42-43.
[4]药典委员会.中国药典[S]. 北京：化学工业出版社，2005：195.
[5]王普，罗旭彪，陈波，等.大孔树脂分离纯化荷叶中阿朴啡类生物碱[J].中草药，2006，37（3）：355-358.
[6]赵骏，李小年.利用大孔树脂纯化荷叶总碱[J].中药材，2003，26（9）：669-670.