Coriolus versicolor固体发酵产漆酶的研究

摘要：研究云芝固体发酵产漆酶的营养条件和培养条件，得出较好的培养基组成：固体发酵基料选择麸皮与花生壳，其合适的比例为1：1，液体营养盐中葡萄糖浓度为0.5%，培养基含水率为70%，初始pH为2.0，接种量为20%、培养温度为30℃。通过对产酶条件的优化，优化后的漆酶的最高酶活力是优化前的4.1倍，杂色云芝在该条件下产漆酶，达到最高酶活需要10天，并且最高酶活可以维持3~4天。

关键词：杂色云芝；固体发酵；漆酶；发酵基料

漆酶最早是在漆树的汁液中发现的，故将其命名为漆酶。漆酶广泛存在大量植物、真菌中。分泌漆酶的真菌主要集中于担子菌亚门(Basidiomycotina )、子囊菌亚门(Ascomycotina)及半知菌亚门(Deuteromycotina)等高等真菌，其中最主要的是担子菌亚门的白腐真菌。漆酶在食品工业、造纸工业、环境保护等领域中具有广泛应用，Pertersen利用漆酶中铜离子的催化特性，除去色拉、蛋黄酱等食品中溶解的氧，消除了食品中的亚麻酸和溶解氧反应生成的挥发性异味组分。Jujiop通过研究发现，用漆酶对木材中的木质素进行处理，可以节省30%的动力。

本实验选用杂色云芝为菌种，着重研究杂色云芝固体发酵产漆酶的营养条件和培养条件，从而提高漆酶的活力，使漆酶能得到高效的应用。

1材料与方法

1.1菌种

杂色云芝菌(Coriolus versicolor)，南京林业大学微生物技术实验室保藏。菌丝体于4℃保存在PDA斜面培养基上。

1.2基本培养基

（1）固体斜面培养基（g/L）：马铃薯200；葡萄糖20；琼脂20。

（2）固体发酵培养基（/瓶）：麸皮5g；花生壳5g；液体营养盐23 mL；吐温80 2滴。

（3）液体营养盐的配制（/L）：葡萄糖5g；(NH4)SO4；KH2P043g；MgS04?7H2O O.5g；愈创木酚4g；CaCl22g；CuSO40.6mg；0.2mol/L pH5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液100mL；微量元素浓缩液1mL。

（4）微量元素浓缩液的配制（g/L）：MnSO4 0.3；FeSO4?7H2O 3；ZnSO4?7H2O 0.3；VB1 0.1。

1.3 培养基中漆酶酶活的测定：

在3mL总反应体积中，含有0.5mmol/L底物[2，2 -连氮-二-（3 - 乙基苯并噻唑-6-磺酸）简称ABTS 1mL，50mmol柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和酶液共计2mL。将缓冲液和ABTS在50℃水浴保温5min后，立即用移液枪添加适量酶液，并同时开始计时，分别测定1min, 2min, 3min时420nm处吸光值。定义每分钟氧化1μmolABTS所需酶量为一个酶活单位（U）。

液体酶活计算方法：液体酶活力（U/L）= OD×V1/( V2×t×ε)

式中： OD：吸光度增加值；t：间隔时间（min）；V1：总反应体积（mL）

V2：酶液体积；ε：消光系数（M-1 cm-1）[ε420= 36000 ×10－6 M-1cm-1]

固体酶活计算方法：固体酶活（U/g原料）=液体酶活力（U/L）×M1×M2

式中： M1：提酶时固体基质（g）与所用的缓冲液（L）的比值

M2：发酵以后固体基质的湿重（g）与固体原料的重量（g）的比值

1.4蛋白含量的测定方法：

采用改良的Bradford法测定

1.5发酵方法

将C. versicolor菌种从PDA培养基上刮到无菌水中，用匀浆机打碎菌丝体，开低档，时间约4s。用移液管吸取3mL菌丝体悬浮液于固体培养基中，在无菌条件下用玻璃棒搅拌均匀。放置在30℃恒温培养箱内培养，并保证一定湿度，培养10天左右。

1.6固体酶曲中漆酶的提取

称取1g湿曲，加入49 mL柠檬酸缓冲液并充分搅匀，40℃下提取1h。然后将浸泡液于10000rpm, 4℃条件下离心5 min，得上清液即初酶液。

2 结果与讨论

2.1最佳固体发酵基料的确定

选用稻草、甘蔗渣、玉米芯、玉米皮、花生壳等纤维废弃物为固体发酵产漆酶的发酵基料，各称取5g放入250ml的三角瓶中，加入5g麸皮、23 mL液体营养盐和2滴吐温80，在30℃的恒温培养箱中培养16天，结果见图1。

图1 不同纤维原料对产酶的影响

由图可知，以花生壳为原料时，云芝分泌漆酶的活力最高（46.4U/g原料)，并且周期较短，达到最高酶活时仅需要8天。这是因为花生壳结构比较疏松，里面的营养物质更容易被菌丝体利用，而且发酵过程中透气性较好。玉米芯也具有与花生壳类似的特点，所以产酶活力也比较高，仅次于花生壳，但是达到最高酶活力的时候比花生壳要多两天。稻草是常见的农业废弃物，但是利用稻草固体发酵产漆酶时，菌体生很缓慢，漆酶分泌量也很少，这可能是因为稻草表面有蜡质，C. versicolor菌丝不能吸收稻草中的营养物质，因而也就不利于菌体产酶。

2.2麸皮和花生壳最佳比例的确定

麸皮与上述五种纤维原料有所不同，除了能够提供必要的碳氮源，还可以为漆酶合成提供丰富的微量元素和生长因子。经过对发酵基料的比较，花生壳的产酶效果相对较好，因此，在确定花生壳作为发酵基料的基础上，着重考察麸皮与花生壳按不同配比混合后，云芝产漆酶的情况。选取11个不同的麸皮与花生壳的比例水平，培养12天，从第6天开始每天取样，选取第6天、第8天、第10天的数据进行比较分析，结果见图2。

在实验过程中，固体基质采用全麸皮的时候，菌丝体生长旺盛，但是漆酶产率较低；固体基质采用全花生壳时虽然菌丝体生长比全麸皮时生长缓慢，但是其漆酶产率比麸皮要高。由此可以看出，麸皮有利于菌丝体生长，花生壳有利于后期的产酶。由图2可知，麸皮和花生壳比例为1:1时，产酶周期较短，漆酶酶活最高为86.6U/g原料。