银杏叶提取物对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用

作者：樊立宏，王坤正，程斌

【关键词】 银杏叶提取物

［摘要］ 目的：探讨银杏叶提取物对兔脊髓缺血再灌注（ischemiareperfusion, IR）损伤的保护作用及其机制。方法：27只新西兰大白兔随机分为假手术组、模型组和银杏叶提取物治疗组，每组9只。建立兔脊髓IR模型。对脊髓IR前及IR后24、48 h实验兔后肢运动功能进行评分，检测缺血脊髓组织中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和丙二醛（malondialdehyde, MDA）的含量，并检测缺血脊髓组织神经细胞的凋亡指数及Bcl2、Bax蛋白的表达水平。结果：银杏叶提取物可明显改善脊髓IR后实验兔的后肢运动功能；提高脊髓组织中SOD的活性，降低MDA的水平；通过上调Bcl2及下调Bax蛋白的表达，抑制IR所致的脊髓神经细胞的凋亡。结论：银杏叶提取物对脊髓IR损伤有一定的保护作用，其机制可能与减轻脊髓神经细胞脂质过氧化损伤和抑制神经细胞的凋亡有关。

［关键词］ 银杏叶提取物; 再灌注损伤; 细胞凋亡; 脊髓; 脂质过氧化作用

Protective effects of ginkgo leaf extracts on neurons in spinal cord after ischemiareperfusion injury in rabbits

ABSTRACT Objective: To observe the protective effects of ginkgo leaf extracts on spinal cord after ischemiareperfusion (IR) injury in rabbits and to find out its possible mechanism. Methods: Twentyseven New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups, which were shamoperation group, untreated group and ginkgo leaf extractstreated group. The locomotor scores of hindlimbs in rabbits after 24 and 48 h of reperfusion were evaluated, and the activity of superoxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) in ischemia spinal cord were examined. The apoptotic index (AI) of neurons in spinal cord was detected by terminal deoxyribonucleotidyl transferase (TdT)mediated dUTPbiotin nick end labeling (TUNEL) method. The expressions of Bcl2 and Bax proteins were examined by streptavidinbiotin peroxidase method. Results: The locomotor scores of hindlimbs in rabbits after 24 and 48 h of reperfusion in the ginkgo leaf extractstreated group were obviously elevated as compared with those in the untreated group (P＜0.05). The activity of SOD was higher and the level of MDA was lower in ischemia spinal cord in the ginkgo leaf extractstreated group than those in the untreated group (P＜0.01). The decreased neuron AI and the expressions of upregulated Bcl2 protein and downregulated Bax protein were also observed in the ginkgo leaf extractstreated group. Conclusion: The protective effects of the ginkgo leaf extracts against spinal cord injury induced by IR may be related to scavenging oxygen free radicals, reducing lipid peroxidation injury and inhibiting apoptosis.

KEY WORDS ginkgo leaf extracts; reperfusion injury; apoptosis; spinal cord; lipid peroxidation

银杏叶提取物是从银杏科植物银杏的叶子中提取的有效成分，研究表明其对心、脑、肝、肾等器官的缺血再灌注（ischemiareperfusion, IR）损伤具有保护作用，但对脊髓缺血再灌注损伤是否有保护作用则鲜见报道。本研究采用兔腹主动脉阻断建立脊髓IR损伤模型，探讨银杏叶提取物对脊髓IR损伤的保护作用及其机制，为临床应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 1级清洁级成年新西兰大白兔27只，雌雄不限，体质量2.4～3.1 kg，平均2.7 kg，由西安交通大学实验动物中心提供，合格证号：医动字第08018。

1.1.2 试剂 细胞凋亡试剂盒、Bcl2和Bax蛋白免疫组化染色试剂盒均购自武汉博士德生物工程公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和丙二醛（malondialdehyde, MDA）测试盒，均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 药物 银杏叶提取物为德国Willmar Schwabe制药厂生产的金纳多（Ginaton）注射液，批号668110，含24％黄酮苷、6％萜内酯（包括银杏内酯A、B、C、J及白果内酯）及70％其他物质（果酸、糖等）。

1.2 兔脊髓IR损伤模型制备 参照Zivin［1］法，用戊巴比妥纳按30 mg/kg予以兔静脉注射麻醉后，于兔左肾动脉起始处下方0.5 cm处夹闭腹主动脉30 min，然后去除血管夹进行再灌注。

1.3 动物分组及药物处理 27只大白兔，随机分为3组：假手术组、模型组和银杏叶提取物治疗组，每组各9只。银杏叶提取物治疗组于腹主动脉夹闭前30 min及再灌注开始后静脉输入银杏叶提取物100 mg/kg。模型组以等量生理盐水替代银杏叶提取物。假手术组仅暴露腹主动脉，不夹闭血管，亦不予以药物处理。

1.4 兔后肢运动功能评分 再灌注24、48 h后分别采用单盲法对兔后肢运动功能进行评分［2］：后肢完全瘫痪，0分；后肢严重的不全瘫痪，1分；后肢可以运动但不能跳跃，2分；后肢可以跳跃但明显不稳，3分；后肢可以跳跃但有轻微不稳，4分；后肢运动功能完全正常，5分。

1.5 脊髓组织指标检测

1.5.1 脊髓组织MDA、SOD含量的检测 再灌注48 h后取缺血部位的脊髓组织，称重后制成匀浆。采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid, TBA）法测定MDA含量；黄嘌呤氧化酶法测定SOD含量。操作步骤均按试剂盒说明书进行。组织蛋白采用考马斯亮蓝G250法进行定量。

1.5.2 脊髓组织细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的检测 再灌注48 h后取L5部位脊髓前角灰质进行检测。采用末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxyribonucleotidyl transferase, TdT）介导的带生物素dUTP缺口末端标记（TdTmediated dUTPbiotin nick end labeling, TUNEL）法原位检测再灌注脊髓组织的细胞凋亡情况；采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶连结法（streptavidinbiotin peroxidase method, SP）检测Bcl2、Bax蛋白的表达。操作步骤均按试剂盒说明书进行。阳性判定标准：TUNEL法为细胞核及核膜被染成棕褐色；SP法为胞浆被染成棕褐色。

1.5.3 计算机图像分析 采用图像分析仪（×900）观察各组实验兔L5脊髓前角灰质的细胞凋亡和免疫组化切片，每张切片随机选取10个视野，计算细胞凋亡指数（apoptotic index, AI）和Bcl2、Bax蛋白的表达水平。

1.6 统计学方法 采用SPSS 10.0软件进行统计学分析，计量资料均数用x±s表示，两样本均数比较采用t检验，后肢运动功能评分比较采用秩和检验。

2 结果

2.1 银杏叶提取物对神经运动功能的影响 假手术组实验兔后肢运动功能正常。模型组和银杏叶提取物治疗组实验兔于缺血再灌注后均出现不同程度的瘫痪，再灌注后24～48 h，部分兔的后肢运动功能再次恶化，甚至出现第2次瘫痪。银杏叶提取物治疗组实验兔后肢运动功能的恢复情况要优于模型组，于IR后24、48 h，两组之间比较有统计学差异。见表1。

2.2 银杏叶提取物对脊髓组织SOD、MDA含量的影响 假手术组实验兔脊髓组织的SOD含量较高，而MDA则处于较低水平。模型组SOD含量则有明显降低，MDA含量明显升高，与假手术组比较有统计学差异。银杏叶提取物治疗组与模型组比较，SOD含量明显升高，MDA含量明显降低，差异有统计学意义。见表2。

2.3 银杏叶提取物对脊髓神经细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响 假手术组脊髓组织未见神经细胞凋亡，Bcl2、Bax蛋白亦呈极少量表达。模型组脊髓组织可见大量凋亡细胞，Bax蛋白在缺血组织中大量表达，而Bcl2蛋白表达则较低，两者比例失调。与模型组比较，银杏叶提取物治疗组凋亡细胞明显减少，Bax蛋白的表达明显降低，Bcl2蛋白的表达则有增高，差异有统计学意义。见表3和图1～7。

表1 银杏叶提取物治疗组和模型组实验兔于IR后24、48 h后肢运动功能评分（略）

Table 1 Locomotor scores of hindlimbs in rabbits after 24 and 48 h of reperfusion in ginkgo leaf extractstreated group and untreated group

*P＜0.05, vs ginkgo leaf extractstreated group.

表2 IR后48 h各组实验兔脊髓组织SOD活性和MDA含量（略）

Table 2 Activity of SOD and content of MDA in ischemia spinal cord in rabbits after 48 h of reperfusion in three groups

**P＜0.01, vs untreated group; P＜0.01, vs shamoperation group.

表3 IR后48 h各组实验兔脊髓组织AI及Bcl2、Bax蛋白表达（略）

Table 3 AI and expressions of Bcl2 and Bax proteins in ischemia spinal cord in rabbits after 48 h of reperfusion in three groups

**P＜0.01, vs untreated group; P＜0.01, vs shamoperation group.

图1 兔脊髓IR损伤后48 h各组脊髓神经细胞的凋亡情况（TUNEL method, ×200）（略）

Figure 1 Neuron apoptosis in ischemia spinal cord in rabbits after 48 h of reperfusion in three groups

A: Shamoperation group; B: Untreated group; C: Ginkgo leaf extractstreated group.

图2 兔脊髓IR损伤后48 h脊髓组织Bax蛋白的表达情况（SP method, ×400）（略）

Figure 2 Bax protein expression in ischemia spinal cord in rabbits after 48 h of reperfusion

A: Untreated group; B: Ginkgo leaf extractstreated group.

图3 兔脊髓IR损伤后48 h脊髓组织Bcl2蛋白的表达情况（SP method, ×400）（略）

Figure 3 Bcl2 protein expression in ischemia spinal cord in rabbits after 48 h of reperfusion

A: Untreated group; B: Ginkgo leaf extractstreated group.

3 讨论

IR损伤时最重要的毒性物质是自由基，而脂质过氧化是其主要的损伤机制。脊髓发生IR后，黄嘌呤、次黄嘌呤等ATP代谢产物及黄嘌呤氧化酶大量生成，并产生大量的氧自由基［3］，作用于细胞膜磷脂，使溶酶体、线粒体和细胞膜遭受破坏。神经组织中的脂质含量较高，因此脊髓对自由基引起的脂质过氧化反应尤为敏感，自由基可通过多种途径（膜损伤、线粒体损伤、DNA直接损伤等）导致脊髓神经细胞发生不同程度的凋亡或坏死。本实验结果发现，脊髓IR损伤动物的后肢运动功能评分与假手术组比较有明显下降，其脊髓组织中脂质过氧化产物MDA的含量升高而抗氧化酶SOD的含量则有明显下降，差异有统计学意义，验证了氧自由基在脊髓IR中所起的损伤作用。

以往认为，脊髓缺血后神经细胞的死亡方式为缺血坏死。但近年来有研究认为，细胞凋亡可能是脊髓缺血后神经细胞死亡的主要方式。Hayashi等［4］报道，脊髓发生IR损伤后，运动神经元的死亡主要与凋亡程序的激活有关。细胞凋亡与多种机制相关，如自由基作用和基因调控。氧自由基可以通过脂质过氧化损伤细胞膜和线粒体膜等途径诱导促凋亡相关蛋白的表达，启动凋亡程序。已有多项研究表明，氧自由基可以通过启动Bcl2、Bax等细胞凋亡相关因素诱导细胞发生凋亡［5］。Bcl2与Bax是重要的凋亡调控基因，前者抑制细胞凋亡，后者促进细胞凋亡。Bcl2与Bax表达的比值可以提示细胞是否发生凋亡，两者比值增高时促进细胞存活，否则细胞发生死亡［6］。本实验结果发现，假手术组脊髓组织中Bax、Bcl2蛋白的表达基本呈阴性；模型组则可见大量凋亡细胞，Bax蛋白在缺血的脊髓组织中大量表达，Bcl2则表达较低，两者比例失调，这与自由基的变化相一致，提示自由基在脊髓IR损伤时对细胞凋亡起着重要的作用。

银杏叶提取物中含有黄酮苷、萜烯内酯这两类主要的活性成分，具有明显的清除自由基的作用。其中黄酮类化合物（山奈酚、槲皮素、异鼠李素等）可显著降低超氧阴离子自由基的浓度。Xin等［7］报道，银杏叶提取物可以通过清除自由基以保护小脑颗粒细胞免受过氧化损伤，并能对抗自由基诱导的神经细胞凋亡。Smith等［8］报道，银杏叶提取物能上调PC12细胞Bcl2的表达、抑制caspase3的激活、下调caspase12及减少细胞色素C的释放，并能减少DNA断裂的发生，从而减少细胞凋亡。Unal等［9］发现，长期给予银杏叶提取物可以增加大鼠局灶性脑缺血后Bcl2基因的表达。本实验结果发现，银杏叶提取物能明显降低IR后脊髓组织中MDA的含量，保护SOD的活性，提示银杏叶提取物能够减轻由氧自由基介导的脂质过氧化反应对脊髓的损害。银杏叶提取物还能抑制脊髓IR后Bax基因的表达，并诱导Bcl2基因的表达，提示其可能通过调节凋亡相关基因的表达而抑制脊髓IR后的细胞凋亡。本实验结果亦显示，银杏叶提取物有较好的清除氧自由基的作用，可通过抗氧自由基损伤来调控凋亡相关基因Bcl2和Bax的表达，抑制IR后脊髓神经细胞的凋亡，对脊髓IR损伤有一定的保护作用。

［参考文献］

1 Zivin JA, DeGirolami U. Spinal cord infarction: a highly reproducible stroke model. Stroke, 1980, 11(2): 200202.

2 Johnson SH, Kraimer JM, Graeber GM. Effects of flunarizine on neurological recovery and spinal cord blood flow in experimental spinal cord ischemia in rabbits. Stroke, 1993, 24(10): 15471553.

3 Basu S, Hellberg A, Ulus AT, et al. Biomarkers of free radical injury during spinal cord ischemia. FEBS Lett, 2001, 508(1): 3638.

4 Hayashi T, Sakurai M, Abe K, et al. Apoptosis of motor neurons with induction of caspases in the spinal cord after ischemia. Stroke, 1998, 29(5): 10071012.

5Polster BM, Fiskum G. Mitochondrial mechanisms of neural cell apoptosis. J Neurochem, 2004, 90(6): 12811289.

6 张建军, 何敢想, 张赤志. 茵陈术附汤对阴黄证大鼠肝细胞凋亡及Bcl2和Bax表达的影响. 中西医结合学报, 2003, 1(2): 116118.

7 Xin W, Wei T, Chen C, et al. Mechanisms of apoptosis in rat cerebellar granule cells induced by hydroxyl radicals and the effects of EGb761 and its constituents. Toxicology, 2000, 148(23): 103110.

8 Smith JV, Burdick AJ, Golik P, et al. Antiapoptotic properties of Ginkgo biloba extract EGb761 in differentiated PC12 cells. Cell Mol Biol, 2002, 48(6): 699707.

9 Unal I, GursoyOzdemir Y, Bolay H, et al. Chronic daily administration of selegiline and EGb761 increased brain’s resistance to ischemia in mice. Brain Res, 2001, 917(2): 174181.