真菌检测技术及其在诊断真菌性角膜炎中的应用

【摘要】 真菌的检测技术从传统的形态学、免疫学发展到分子生物学水平，并逐渐应用于角膜真菌感染的研究。本文就全身及角膜真菌感染的检测技术研究进展作一综述，以期为寻求更为快速、特异、敏感的真菌性角膜炎的诊断手段提供帮助。

【关键词】 真菌性角膜炎 检测技术 诊断

真菌性角膜炎是一种严重危害视功能的感染性眼病，发病率逐年增加，治疗棘手。正确的早期诊断、治疗是取得良好疗效的关键。近年来，随着科技的进步和研究的深入，真菌的检测技术从传统的形态学、免疫学发展到分子生物学水平，并逐渐应用于角膜真菌感染的临床和实验研究，有望为真菌性角膜炎的诊断提供更为快速、特异、敏感的途径。

一 真菌的检测技术

（一）常规镜检及培养、鉴定

1．镜检

对临床标本的直接显微镜检查是最简单也是最有用的实验室诊断方法。直接镜检对于浅表和皮下真菌的感染最有帮助，可在几分钟内完成，并且很多情况下观察到的真菌形态可以提供很有价值的临床信息，还能给技术人员提供有效分离出可疑病原菌的有用信息[1]。直接镜检可采用不染色的湿片法如氢氧化钾（KOH）涂片或Gram染色涂片，染色检查包括革兰氏染色、抗酸染色、Gimsa染色、PAS染色、组织病理染色、荧光检查和巴氏染色法等。

2．培养、鉴定

对临床标本直接镜检时不管看到什么，都应进行常规分离培养，必要时可使用辅助鉴定培养基。对致病真菌培养的目的是为了进一步提高对病原体检出的阳性率，同时确定致病菌的种类，因此强调直接镜检与培养检查相结合[2]。常规分离鉴定使用的培养基为沙氏葡萄琼脂斜面培养基，加0.05%氯霉素，有时根据需要还可选用不同性质的培养基。

真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。菌种的鉴定是一个复杂过程，仅观察菌落形态是不够的，有时还需作生化反应、分子生物学鉴定，必要时将菌种送有关单位鉴定。

（二）免疫学方法

免疫学方法的基本原理是利用抗原与抗体的特异结合，来达到相互间的特异探察，是一种综合定性、定位和定量，形态、机能和代谢密切结合的研究和检测技术。该法主要用于检测真菌的抗原、抗体、代谢产物及细胞成分，能根据真菌抗原性的不同将真菌分类，但关键的是抗体的特异性。

1．免疫组化

免疫组化通过检测特异性真菌抗原诊断组织中的病原体，还可使组织中稀少存在的孢子更易发现。目前应用免疫组化检测的真菌主要有：（1）双相真菌，如孢子菌、皮炎芽生菌、人类组织胞浆菌等；（2）酵母菌，如念珠菌、隐球菌、毛孢子菌等；（3）丝状真菌，如曲霉菌、镰刀菌、毛霉菌等。该法的缺点是容易发生交叉反应，所以，在评价免疫组化时，应列出抗体能检测的一系列真菌[3]。获得标准和经济适用的单克隆抗体可使该技术得到广泛应用。

2．酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA是运用酶标记免疫技术进行液体标本中微量物质测定的实验方法，可根据不同的检测目的、试剂来源和实验条件，设计出多种类型的ELISA。如Diez等[4]采用一种新的特殊的单克隆抗体抑制酶联免疫吸附试验（inh-ELISA）方法来诊断副球孢子菌，敏感性达80.4%，特异性达81.4%；Verweij等[5]应用双抗体夹心ELISA检测侵袭性曲霉病标本中的半乳糖甘露乳糖，灵敏度为90%，特异性为84%。

3．免疫印迹法

免疫印迹显示经单向或双向电泳后分离的烟曲霉蛋白约有100种蛋白质或糖蛋白与人的免疫球蛋白结合，因此曾一度认为此技术可作为烟曲霉病血清学诊断的标准[6]。但有些抗原因化学修饰不同而改变分子大小，免疫印迹常不能确定它的抗原特异性。此法常用于微量蛋白水平的测定。

4．凝集反应

该法敏感度高，方法简便，已广泛用于真菌的鉴定、分型。Mitsutake等[7]统计应用胶乳凝集试验检查念珠菌，其热敏性糖蛋白抗原阳性率76.9%，特异性87.5%；甘露聚糖抗原阳性率75.6%，特异性100%。

5．免疫亲和柱

免疫亲和柱是利用真菌毒素特异性抗体制成的一种新的净化技术，在真菌毒素的分析检测中应用越来越广泛。目前，该法在欧洲已作为一种常用的净化手段用于各种体液中黄曲霉素的分析，与液相色谱系统相联接还有利于样品的自动化分析[8]。免疫亲和柱具有灵敏度高、选择性好、耗时少、使用方便、节省溶剂等优点，主要缺点是价格较高，商品化产品少。

6．其它

用于检测微生物的免疫学方法还很多，有时可根据真菌的不同特点选用不同的方法。例如，（13）-β-D葡聚糖占真菌胞壁成分50%以上，应用比色法能检测到皮克水平，可用于检测深部真菌感染[9]；AFMP1是一种编码半乳糖露乳糖的基因，用胶体金标记的免疫电镜可观测到位于烟曲霉菌丝和分生孢子的细胞壁中的afmplp蛋白[10]。

(三)分子生物学技术

1．原位杂交

原位杂交利用核酸分子碱基配对互补的原则来检测目的基因，目前已用于念珠菌[11]、曲霉菌[12]等真菌感染的研究。真菌感染原位杂交检测的关键是探针的设计，目前所用的探针大多是合成的寡核苷酸探针，靶序列均为 rRNA，不仅可以确定特异的病原体，而且可以判断其生命力。随着更多真菌的属特异和种特异探针的设计，将进一步提高它的敏感性和特异性，以用于临床协助作出快速准确的诊断。此法的缺点是定量较困难，且不精确。

2．聚合酶链反应（PCR）

PCR技术自上世纪90年代开始用于真菌的检测，目前已广泛用于实验室、临床中各种真菌的研究。该技术能检测真菌的多糖、蛋白及DNA等，结合限制性内切酶分析能将临床真菌鉴定到菌种水平[13]，荧光定量PCR技术能对扩增产物进行定量分析[14]，针对真菌的共同序列而设计的“全能引物"可快速明确体内有无真菌感染[15]。PCR技术操作简便、省时省工，敏感性和特异性高，正逐渐成为临床上诊断真菌感染的常规技术。

3．DNA中G+C mol%含量测定

这是最早用于真菌分类学研究的分子生物学技术，因为每种真菌都有固定的DNA G+Cmol%范围，且较为稳定，数值随着真菌由低等向高等菌属进化而递增，因而可作为真菌的分类学指标。目前这一技术主要应用于酵母菌，其DNA G+Cmol%的属间差异范围界定为10%[16]。

4．随机扩增多态性DNA(RAPD)分析[17]

RAPD主要用于酵母菌和丝状真菌的鉴定、分类和流行病学研究，最明显的优点是不需要抽提大量DNA，从临床标本中可直接检测，并同时进行种间鉴定和种内分型，方法快速、简便，适于大规模使用。

5.限制性内切酶多态性分析（RFLP）[18]

原则上只要内切酶选择合适，便能对所有真菌显示分类上的多态性和特异性，常与PCR技术、杂交技术结合起来以精细区别不同来源的菌株。RFLP不需要特殊的实验仪器，一般实验室条件即可完成，便于普及。

6．其它

用于真菌鉴定、分类的分子生物学技术还有电泳核型（EK）、核糖分型、rRNA序列分析、可溶性蛋白电泳、多位点酶电泳等，但目前多局限于实验室研究，真正应用于临床尚需进一步标准化。

分子生物学技术应用于真菌研究已显示出多方面的优点，医学真菌研究已逐渐形成了以基因分析为基础的鉴定和分类系统。随着研究的不断扩大和深入，分子生物学技术配合形态学、免疫学等方法，必将对真菌诊断学的发展起巨大的推动作用。

（四）其它

1．流氏细胞技术（FCM）[19]

FCM是一种高速单细胞定量分析和分选的先进方法，近年来已逐渐应用于真菌学的研究，如观察几丁质的合成，芽生孢子的计数和活性判断，测定真菌的黏附能力和DNA含量等。它具有实验速度快、制备菌液时间短、精确度高、误差小等优点，可以多方面获得真菌细胞的信息，有望为真菌病的深入研究发挥重要作用。

2．化学方法[20]

主要用于检测真菌的辅酶Q系统以实现对真菌属及属上水平的分类，从而避免由于菌细胞形态类似、胞壁的化学组成相近、菌对营养需求的近似和免疫学的交叉反应等所带来的分类混乱，使真菌分类更加科学化。

此外，尚有利用底物检查真菌的特异性酶、生化反应等方法用于检测真菌。

二 角膜真菌感染的检测

（一）角膜刮片镜检

1．普通光镜检查

（1）KOH湿片法

该法利用KOH能消化刮片中的非真菌杂质而显示菌丝，但阳性率不超过50%，易出现假阳性或假阴性。有报道称将KOH与墨汁[1]或二甲基亚砜[21]混合使用，可增加背景对比使效果更佳。

（2）Gram和Gimsa染色法

能非特异着染丝状菌胞浆，方法较KOH湿片法敏感，阳性率在45~75%之间，但不能使菌丝着染，且染色有沉淀[22]。

（3）过碘酸-Schiff（PAS）染色法和六亚基四胺银（GMS）染色法[22]

能特异性着染真菌胞壁。PAS染色中，真菌细胞壁中碳水化合物上的羟基被氧化为醛，醛基与复红形成淡红色化合物，若用孔雀绿复染，真菌更易区别；GMS染色法中，锘酸能将真菌胞壁中的多糖氧化为醛，后者使六胺银还原为银，不但能使真菌着染，还能使真菌胞壁及胞隔清晰着染，有报道称其检出率达89%。这两种方法的缺点是需要特殊化学试剂，费时较长。

2．荧光显微镜检查

目前常用的有钙荧光白 (CFW)染色法和吖啶橙染色法。吖啶橙燃料能与真菌DNA结合，在黑背景下显示橙绿色真菌。CFW能与真菌胞壁的几丁质和纤维素紧密结合，使菌丝发出明亮的淡兰色荧光，在荧光显微镜下真菌轮廓和黑暗背景对比明显，易于分辨。CFW还能检测活体标本，适于术中真菌的快速诊断[23]。本法与普通光镜相比，最突出的特点是敏感性高，但工具要求较高，试剂不易购买等缺点使它的广泛应用受到限制。

（二）真菌培养[2]

临床上对角膜刮片都应进行常规培养，大多数角膜感染的真菌至少3天才能生长，培养1周以上才能确定是否为真菌感染。为了分离鉴定真菌，有时需要辅助培养基。角膜刮片或组织培养是诊断真菌感染的最可靠依据，同时可鉴定真菌菌种，进行药敏实验，为临床上选择敏感药物治疗提供依据。此法的缺点是耗时长，明确诊断时往往影响治疗，且培养结果受取样的影响较大。

（三）角膜活检[24]

通常在临床上，对疑为角膜真菌感染患者，在角膜刮片和真菌培养阴性，或深层浸润难以用角膜刮片获取标本者；对已确认单疱病毒性角膜炎，在用抗病毒药物联合皮质类固醇治疗期间病情恶化者，行角膜活检极为有用。取得的标本进行镜检、培养可对角膜真菌感染做到快速、正确的诊断，比单纯角膜刮片更为优越。但是，当角膜溃疡大、深者，容易造成角膜穿孔。

（四）凝集素组织化学染色

凝集素属于蛋白或糖蛋白，能与其特异性糖基相结合，用来探察真菌细胞壁上的糖基受体，从而检测真菌的有无及鉴别其种属。凝集素还能与荧光素、生物素、酶、胶体金等示踪物结合，在光镜或电镜水平显示其结合部位。Thomas等[22]发现不同荧光标记凝集素可以与不同真菌细胞壁的几丁质结合，发出特异荧光，以鉴别菌种；Garcia等[25]认为过氧化物酶标记的植物凝集素在诊断实验性角膜真菌感染，具有较高的特异性和敏感性，是一种可靠的诊断方法。

（五）共焦显微镜检查

共焦显微镜检查是一种快速、有效、无创性的活体检查手段，能从四维水平进行扫描成像，动态观察角膜组织中的菌丝。谢立信等[26]进行了大宗病历的临床共焦显微镜技术检查，发现了它具有其它方法不能比拟的优点：1.对角膜无损伤；2.检查速度快，范围全面；3.阳性率高达96.9%；李绍伟等[27]研究共焦显微镜检查常见真菌性角膜炎的图象特点，认为该法对真菌性角膜炎的鉴别诊断有重要的参考价值。然而，该法仅对浅层菌丝的检测效果较好，当感染波及角膜全层时，对深层的菌丝和组织难以检查出清晰的图象[26]，且对菌种的鉴别尚不成熟，设备的昂贵限制了它的进一步普及。

（六）聚合酶链反应(PCR)

近年来，敏感、快速等特点使得PCR技术在诊断真菌性角膜炎中得到越来越广泛的应用。选择真菌基因中不同的目的片段而设计引物，能特异性地检测真菌，如，Alexandrakis等[28]将PCR用于检查镰刀菌引起的兔真菌性角膜炎，敏感性达89%；Kumar等[29]成功将PCR结合单链构象多态性(SSCP)分析应用于临床中烟曲菌角膜炎的诊断。Gaudio等[2]将PCR与培养技术相比较，其中74%的结果一致，10%的病例PCR为阳性，培养阴性，3%的病例PCR为阴性，培养阳性，认为PCR对临床角膜真菌的诊断具有广阔的应用前景。

三 小结

随着角膜真菌感染发病率的日益增高，早期诊断、早期治疗已成为目前临床的迫切需求。虽然真菌的实验室检测技术日趋成熟，但能应用于诊断临床角膜真菌感染的手段依然有限，各种方法各有利弊。借鉴真菌检测技术的研究成果，寻求更为快速、准确、简便、特异、敏感的技术用于临床角膜真菌的检测及鉴定其种属，将使真菌性角膜炎得到良好的预防和控制。

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