ThIPK2基因植物表达载体的构建

重点实验室/小麦玉米国家工程实验室，山东济南250100）

摘要：为培育高度抗逆和无选择标记的转基因小麦，本研究从NCBI数据库中搜索到ThIPK2基因序列，依据该基因编码的氨基酸序列，参照小麦偏爱的密码子对该基因进行密码子优化，并将重复的和不必要的酶切位点去掉后进行人工合成。将改造后的ThIPK2基因插入到强启动子Ubiquitin和终止子AtSac66之间，然后将其插入到含有玉米Ac/Ds转座子背景骨架的植物表达载体中，获得了具有删除选择标记功能的、由玉米Ubiquitin启动子驱动ThIPK2基因的植物表达载体。经过限制性内切酶分析鉴定，该植物表达载体构建成功。

关键词：ThIPK2基因；密码子优化；表达载体构建

中图分类号：Q786文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）05-0018-06

小麦是世界上分布最广、种植面积最大的粮食作物之一。随着人口增多和自然环境的不断恶化、水资源短缺以及土壤盐碱化，培育抗逆小麦品种已成为当务之急。传统的小麦育种主要利用品种间杂交，而基因工程技术的发展和应用，打破了物种间基因流动的限制，将外源基因导入小麦细胞并获得转基因植株，为小麦育种开辟了新途径，对提高小麦耐盐抗旱性具有重要的战略意义。

磷脂酰肌醇信号传导途径在植物生长发育和感受刺激并对之应答的过程中发挥十分重要的作用。多磷酸肌醇激酶/三磷酸肌醇3激酶（inositol polyphosphate kinase/inositol 1，4，5-trisphosphate 3-kinase， IPK2/IP3K）是该信号途径中的一个关键酶，磷酸化IP3成为1，3，4，5-四磷酸肌醇（inositol 1，3，4，5-tetrakisphosphate， IP4）和1，3，4，5，6-五磷酸肌醇（1，3，4，5，6-pentakisphospate， IP5），IP4能够与IP3协同作用调节胞外钙离子入膜和维持细胞内钙离子平衡。因此，IPK2在协调IP3和IP4水平、维持钙离子稳态过程中起关键作用，参与了多种生理过程的调控。有研究报道，IPK2与植物对盐胁迫等非生物胁迫的应答有关。例如Yang等[1]的研究表明，IPK2具有增强转基因烟草耐受高盐胁迫和渗透胁迫的能力。Zhu等[2]从盐芥（Thellungiella halophila）克隆基因ThIPK2，并将该基因转化到油菜（Brassica napus L cv）沪油1号中，结果表明转ThIPK2基因油菜植株表现出较强抗盐、抗旱和抗氧化的特点。进一步的研究表明，在转基因油菜中，ThIPK2基因的表达能提高胁迫应答基因的转录和改善脂肪酸的组成；在盐胁迫下转ThIPK2具有提高植物抗干旱和耐低温胁迫的能力。在上述研究的基础上，本工作准备利用ThIPK2基因通过转基因技术对小麦的抗逆性进行遗传改良。

另外，遗传密码子有64种，但绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分，表现出某种程度的密码子利用的差异或偏爱。利用偏爱密码子避免利用率低的或稀有的密码子称为密码子优化。为了提高目的基因ThIPK2的表达量，本研究根据小麦的偏爱性密码子对该基因进行了密码子优化。

有效的筛选标记基因对于转基因植物的获得至关重要，目前常用的标记基因如新霉素磷酸转移酶（neomycin phosphotransferaseⅡ）NPTⅡ基因、潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase）HPT基因等抗生素抗性基因及膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinothricin acetyltransferase）Bar基因、乙酰乳酸合成酶（acetolactate synthase）ALS基因等。但这些标记基因滞留在植物体内并持久表达不仅会给植物生长带来负担，而且还会给其他有利性状基因的表达带来一定的影响，因此它们的使用也引发了人们对转基因安全性的隐忧[3～6]。为了解决这些弊端，获取无选择标记的转基因植物，应运而生了玉米的Ac/Ds转座子系统，该系统作为无选择标记基因的载体，利用了Ds元件能从染色体的一个位点转移到另一个位点的特性，再通过后代重组自交与原初位点上的标记基因及Ac元件分离，进而得到只含有Ds元件的转基因植株。该系统已经被应用于多种异源植物如转基因番茄[7]、烟草[8]、水稻[9]、油菜[10]中并取得成功。

本研究利用DNA重组技术，构建了一个含有密码子优化后的ThIPK2基因、强启动子Ubiquitin及Ac/Ds转座子的植物表达载体。该载体可进一步用于小麦的遗传转化，以期获得高抗逆性及无选择标记基因的转基因小麦植株。

1材料与方法

11材料

111质粒和菌株载体pBluescript SK、pBIOS1487、pBIOS645和pBIOS1717由本实验室保存。大肠杆菌DH5α购自全式金公司。

112药品及试剂高保真酶 Fast-pfu购自全式金公司；限制性内切酶EcoR Ⅴ、SalⅠ、SmaⅠ和NcoⅠ购自Fermentas公司；SalⅠ和PmeⅠ购自NEB（New England Biolabs）公司；DN段回收试剂盒购自Axygen公司；T4连接酶购自NEB公司；测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

12载体的构建

121ThIPK2基因的密码子优化从NCBI网站上获得ThIPK2基因序列和蛋白序列，根据野生型ThIPK2基因及蛋白的序列，参考小麦偏爱的密码子，将重复的和不必要的酶切位点去掉，并兼顾优化后低水平的GC含量，对ThIPK2基因进行密码子优化。

122载体PSAA001的构建合成优化好的ThIPK2基因序列（synZPK2）并连接到载体pBluescript SK，然后通过测序的方式鉴定目的序列的插入方向，完成载体PSAA001的构建。这一步由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，流程图中未列出。

123载体PSAA002的构建用SalⅠ和NcoⅠ双酶切载体PSAA001和pBIOS1487，将目的片段Ubiquitin启动子连接到PSAA001 ThIPK2基因的上游，转化Ecoli，对重组质粒进行酶切检测。

124载体PSAA003的构建SalⅠ和SmaⅠ双酶切载体PSAA002，用SalⅠ和EcoRⅤ双酶切载体pBIOS645，将目的片段AtSac66终止子连接到PSAA002 ThIPK2基因的下游，转化Ecoli，对重组质粒进行酶切检测。因为SmaⅠ和EcoRⅤ这两种酶都是平末端限制性内切酶，酶切后产生的都是平末端，可以用T4连接酶进行连接。

125载体PSAA004的构建用SalⅠ和PmeⅠ双酶切载体PSAA003和pBIOS1717，将上下游分别连接有启动子和终止子的ThIPK2基因序列连接到植物表达载体骨架上，转化Ecoli，对重组质粒进行酶切检测。