小鼠经鼻腔给药醒脑静微乳和mPEG2000―PLA修饰醒脑静微乳后体内栀子苷的动力学比较研究

[摘要]该实验建立了小鼠体内醒脑静微乳和mPEG2000-PLA修饰醒脑静微乳鼻腔给药后测定血浆栀子苷浓度的高效液相色谱法，探讨2种制剂经鼻腔给药后栀子苷在小鼠体内的药动学过程。将80只小鼠分为2组，分别鼻腔给药醒脑静微乳和mPEG2000-PLA修饰醒脑静微乳后，于不同时间点摘眼球取血，HPLC测定血浆中栀子苷的量，以Kinetica软件非房室模型拟合药动学参数。结果显示小鼠鼻腔给药醒脑静微乳后，血药主要药动学参数为Cmax（4.36±2.69）mg・L-1，tmax1 min，MRT（29.73±4.54）min，AUC（53.63±14.03） mg・L-1・min；小鼠鼻腔给药共聚物修饰醒脑静微乳后，血药主要药动学参数为Cmax（9.75±4.14）mg・L-1，tmax 1 min，MRT（22.34±2.90）min，AUC（131.87±40.13）mg・L-1・min。与醒脑静微乳相比，共聚物修饰醒脑静微乳经小鼠鼻腔给药后，栀子苷入血程度更高，可能与其刺激性较小而吸收较多有关。

[关键词]醒脑静微乳； mPEG2000-PLA； 栀子苷； 鼻腔给药； 药动学

醒脑静主要由麝香、郁金、栀子、艾片组成，具开窍醒脑、凉血活血、清热解毒之功效，为临床救急必备用药之一。醒脑静处方中既有脂溶性成分也有水溶性成分，而微乳作为一种热力学稳定的油水混合体系，可同时溶解水溶性和脂溶性2部分成分，因此本实验室前期将醒脑静制备成微乳制剂[1]。考虑到微乳中药物及表面活性剂对鼻黏膜有一定的刺激性[2]，实验室前期以聚乙醇单甲醚2000-聚乳酸（mPEG2000-PLA）嵌段共聚物替代部分表面活性剂修饰醒脑静微乳制备了共聚物修饰醒脑静微乳，通过考察两者对鼻黏膜刺激性发现长期给药共聚物修饰微乳可表现出降低对鼻黏膜刺激性的作用[3]。为了进一步研究2种微乳的药动学差异，为醒脑静制剂合理用药提供药动学实验依据，本实验研究了2种醒脑静微乳中栀子苷在小鼠体内的药动学过程。

1 材料

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Sartorius BS 110S型电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；G16型医用高速离心机（白洋离心机厂）；MX-S涡旋仪（北京大龙兴创实验仪器有限公司，Dragon Lab）；IKA匀浆机（德国）。

栀子苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号110749-201115）；醒脑静微乳、mPEG2000-PLA修饰醒脑静微乳（实验室自制，栀子苷质量分数均为20.2 g・L-1）；乙腈、甲醇（美国Fisher公司，色谱纯）；纯净水（杭州娃哈哈集团）；其余试剂均为分析纯。

ICR小鼠，雄性，18～20 g（北京维通利华实验动物技术有限公司），合格证编号SCXK（京）2012-0001）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

DiamonsilTM钻石C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈-水（14∶86）；检测波长238 nm；流速1.0 mL・min-1；柱温室温。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取栀子苷对照品10.03 mg，置10 mL量瓶中，乙腈溶解并稀释至刻度，得质量浓度为1.003 g・L-1储备液。

2.3 样品采集与处理方法

摘眼球取血后肝素抗凝，离心分离血浆备用。吸取小鼠血浆100 μL，加入乙腈300 μL沉淀血浆蛋白，漩涡混合器振荡60 s，10 000 r・min-1高速离心10 min，吸取上清液360 μL，60 ℃水浴，空气吹干，加入甲醇100 μL振荡30 s，10 000 r・min-1高速离心10 min，取上清液20 μL进样。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 样品按2.3项下方法处理，按2.1项下色谱条件测定。结果栀子苷的保留时间为14.2 min。小鼠空白血浆的内源性物质对栀子苷的测定均无干扰。结果见图1。

2.4.2 线性关系考察 取对照品储备液，用乙腈分别稀释成质量浓度为2.76，5.52，11.03，22.07，55.17，110.33，160.48，200.6 mg・L-1的栀子苷溶液，各取10 μL加入空白1.5 mL离心管中，吹干，加入小鼠空白血浆100 μL，涡旋混合30 s，按2.3项下处理，进样分析。以栀子苷质量浓度C（mg・L-1）为横坐标，以栀子苷峰面积A为纵坐标，进行线性回归，得到回归方程为A=15 217C+851.82，r=0.999 9，血浆中栀子苷质量浓度在0.28～20.06 mg・L-1，峰面积与血浆药物浓度呈良好的线性关系。

2.4.3 精密度试验 取栀子苷对照品溶液置1.5 mL离心管中吹干，加入小鼠空白血浆100 μL，使血浆中栀子苷质量浓度分别为0.28，2.21，20.06 mg・L-1。按2.3项下方法处理（n=5），结果栀子苷质量浓度分别为0.28，2.21，20.06 mg・L-1的血浆日内精密度的RSD分别为4.1%，0.33%，1.1%，日间精密度的RSD分别为2.0%，1.3%，0.38%。

2.4.4 回收率试验 取栀子苷对照品溶液10 μL置1.5 mL离心管中吹干，加入空白小鼠血浆100 μL，使血浆中栀子苷质量浓度分别为0.28，2.21，20.06 mg・L-1。按2.3项下方法处理，进样分析，代入标准曲线计算测得的血浆含药量，与理论值进行比较，计算方法回收率。另以蒸馏水替代空白血浆进行前述样品的制备，进样分析，将所得各浓度的血浆样品峰面积与蒸馏水样品峰面积进行比较，计算萃取回收率。低、中、高浓度的方法回收率分别为96.74%，98.30%，99.48%；萃取回收率分别为97.36%，92.75%，90.83%。

2.4.5 最低检测限 在本实验的色谱条件下，最低检测限为25 μg・L-1（S/N≥3），达到栀子苷体内分析要求。

2.5 药动学试验

取雄性ICR小鼠80只，体重18～20 g，随机分为2组，分为醒脑静微乳鼻腔给药组（Ⅰ），共聚物修饰醒脑静微乳鼻腔给药组（Ⅱ），每组40只，于实验前12 h禁食，自由饮水。小鼠按4 μL/只（即栀子苷4.04 mg・kg-1）给药。鼻腔给药时，以乙醚麻醉小鼠，固定头部，用连接PE塑料软管的微量注射器插入小鼠鼻腔内约0.2 cm，将定量药物给入鼻腔，观察是否有药液从小鼠鼻腔流失。给药后，分别于1，3，5，10，30，60，90，120 min取血，每个时间点各5只小鼠。按2.3项下方法操作，按2.1项下方法测定，代入线性方程计算不同时间点栀子苷的血药浓度。平均血药浓度药时曲线分别见图2。栀子苷血药浓度药时数据用Kinetica药动学软件非房室模型拟合，主要药动学参数见表1。

3 讨论

作为一种新型的高分子材料，聚乳酸（PLA）具有生物可降解性，当其进入体内后，代谢为乳酸，最终转化为CO2和H2O，均是体内正常代谢产物[4]，具有可靠的生物安全性，因此已被美国FDA批准使用并广泛应用于组织工程、药物控释系统等多个方面[5]。聚乙二醇单甲醚（mPEG）是一种聚醚高分子材料，亲水性佳，生物相容性良好，作为亲水性链段，与疏水性链段PLA聚合而成的mPEG-PLA嵌段共聚物，具有独特的可降解两亲结构，在药物缓释方面有着巨大的发展潜力。本研究通过对用mPEG2000-PLA嵌段共聚物修饰的醒脑静微乳中栀子苷药动学的研究，拟探讨mPEG2000-PLA共聚物对药物体内特征的影响。

本实验采用HPLC-UV测定醒脑静微乳鼻腔给药后血浆中栀子苷的量，结果栀子苷的保留时间约14.2 min，与小鼠空白血浆比较，给药后小鼠血浆中的栀子苷能较好地分离，不受代谢产物及内源性物质的干扰。在预实验中，分别考察了内标法和外标法测定血样中栀子苷含量，在对外标法进行方法学验证后，发现其线性关系、日内精密度、日间精密度和回收率均符合要求，可满足醒脑静微乳给药后栀子苷药动学研究的要求，因此本实验采用了更为简便且易操作的外标法进行定量。

2种微乳经鼻腔给药后，栀子苷均可迅速吸收入血，且代谢较快；与醒脑静滴鼻液鼻腔给药相比（tmax 3 min）[6]，体现了微乳与鼻腔有更强的亲和性，可以迅速通过鼻黏膜进入血液[7]。与普通醒脑静微乳相比，mPEG2000-PLA共聚物修饰醒脑静微乳小鼠鼻腔给药后Cmax和AUC显著高于普通微乳组，栀子苷经鼻吸收入血程度更高，其原因可能为共聚物修饰微乳对鼻黏膜刺激较小，而能减少鼻腔黏液蛋白的分泌，从而避免其对药物吸收的影响，因此更有利于药物在鼻腔的吸收；也可能是微乳经mPEG2000-PLA修饰后与鼻黏膜的亲和性更强，其作用机制有待于进一步研究。

[参考文献]

[1] 王珊，杜守颖，陆洋，等. 醒脑静微乳的体外释放研究[J]. 中国中药杂志，2011，36（16）：2196.

[2] 赵雪姣，陆洋，杜守颖，等. 醒脑静微乳对大鼠鼻黏膜刺激性研究[J]. 北京中医药大学学报，2012，35（9）：626.

[3] 赵雪姣. mPEG2000-PLA修饰醒脑静微乳制备及评价研究[D].北京：北京中医药大学，2013.

[4] Salaam L E， Dean D， Bray T L. In vitro degradation behavior ofbiodegradable4-star micelles[J]. Polymer， 2006， 47（1）： 310.

[5] Lee W C， Li Y C， Chu I M. Amphiphilic poly （D，L-lactic acid）/poly（ethyleneglycol）/poly（D，L-lactic acid） nanogels for controlled releaseof hydrophobic drugs[J]. Macromol Biosci，2006，6（10）：846.

[6] 陆洋. 醒脑静有效成分鼻腔吸收及脑靶向性的研究[D]. 北京：北京中医药大学，2010.

[7] 邬伟魁， 张海燕， 宋伟，等. 中药经鼻腔给药研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2011，17（20）：288.

Study on pharmacokinetics of geniposide in mice administrated by Xingnaojing

microemulsion and mPEG2000-PLA modified Xingnaojing microemulsion

WEN Ran CHEN Xiao-lan LI Hui-yun GUO Qing-li LU Yang DU Shou-ying1*

（1.School of Chinese Pharmacy， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China；

2. Department of Materia Medica， Guiyang Institute of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550002， China）

[Abstract] An HPLC method for the determination of geniposide concentration in mouse plasma was developed and the pharmacokinetics after intranasal administration of Xingnaojing microemulsion （XNJ-M） and mPEG2000-PLA modified Xingnaojing microemulsion （XNJ-MM） were investigated. Eighty mice were treated by XNJ-M and XNJ-MM nasally. The plasma samples were collected at different times and the drug in samples was detected by HPLC. The pharmacokinetic parameters were calculated by the software of Kinetica. The pharmacokinetic parameters of geniposideof XNJ-M were Cmax（4.36±2.69） mg・L-1， tmax1 min， MRT（29.73±4.54）min， AUC（53.63±14.03） mg・L-1・min. The pharmacokinetic parameters of geniposide of XNJ-MM were Cmax（9.75±4.14） mg・L-1， tmax1 min， MRT（22.34±2.90） min， AUC（131.87±40.13） mg・L-1・min. Geniposide can be absorbed into bloodin a higher degree after intranasal administration with XNJ-MM compared to XNJ-M， which maybe caused by its less irritating and more absorption.

[Key words] Xingnaojing microemulsion； mPEG2000-PLA； geniposide； intranasal administration； pharmacokinetics

doi：10.4268/cjcmm20140631