过表达间隙连接蛋白CX26 Y155X突变体增加细胞对内质网应激的敏感性

【摘要】 目的 体外实验探讨间隙连接蛋白神经性耳聋相关突变CX26 Y155X突变体导致耳聋可能的致病机制。方法 HEK293细胞中过表达CX26 Y155X突变体质粒后，免疫印迹检测CX26的表达，流式细胞术检测细胞内活性氧物质的改变和内质网应激诱导剂诱导凋亡改变情况。结果 过表达CX26 Y155X突变体能增加细胞内ROS的水平，同时能增加内质网应激诱导剂对细胞的促凋亡作用。结论 CX26 Y155X突变体可能由于异常聚集于内质网，从而导致内质网应激，产生过多的ROS，增加细胞对内质网应激的敏感性，从而诱导细胞凋亡。

【关键词】 间隙连接蛋白；CX26；内质网应激；凋亡

耳聋是引起交流障碍最常见的疾病，新生儿中先天性重度以上耳聋的发病率高达1-3/1000，其中一半是遗传因素所致。遗传性耳聋中约30%是综合征性聋，约70%属于非综合征性聋。在非综合征性聋中，常染色体显性遗传（DFNA）约占15%，常染色体隐性遗传（DFNB）约占80%，X连锁遗传（DFN）约占3%-5%，线粒体基因突变母系遗传约为1%。在DFNB中，约占50%以上患者是由GJB2（Connexin 26，CX26）基因缺陷所致。GJB2基因缺陷还与常染色体显性遗传性聋（DFNA）和综合征性聋有关，是最常见的耳聋基因[1]。在GJB2基因中，已发现100余种突变与耳聋有关（http：//davinci.crg.es/deafness/），该基因的突变具有种族和地域特征。在高加索人种中，约50%的遗传性非综合征性聋是GJB2突变所致，编码区第35位鸟苷酸缺失（35delG）占该基因总突变的50%-86%，犹太人的突变热点是167delT，我国和日本等东亚人中最常见的突变是235delC[2-3]。GJB2基因编码的间隙连接蛋白26（Connexin 26，CX26）是间隙连接蛋白家族中重要的一员，在内耳中是K+和IP3等第二信使分子的通道，对听觉生理和病理，具有重要作用[4]。

我们以往的研究在中国人群中发现的一个新突变，该突变为无义突变（c.465 TA），导致155位脯氨酸变为终止密码子（155Tyrstop）[5]。同时我们的研究也显示截短突变后的Y155X蛋白聚集于内质网，不能正确定位到细胞膜中[5]。我们探讨异常聚集于内质网的Y155X突变体的可能的致病机制，我们在体外对Y155X突变体进行了过表达，检测内质网应激可能导致的细胞活性氧物质（ROS）的改变和对内质网应激诱导剂的敏感性改变情况。

1 材料与方法

1.1 材料 蛋白电泳及转膜设备购自Bio-Rad公司，CO2配养箱购自Forma公司，ECL试剂盒购自GE公司，Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司，胎牛血清（FBS）购自GIBICO公司，Anti-myc单克隆抗体、Anti-β-actin单克隆抗体均购自sigma公司，Annix-V+PI凋亡检测试剂盒和DCF-DA购自Sigma公司；HRP标记的山羊抗鼠IgG购自KPL公司，HEK293细胞株由医学遗传学国家重点实验室冻存。pCDNA3.1-CX26-Y155X-myc和pCDNA3.1-CX26 WT-myc质粒为我们前期工作中构建。

1.2 方法

1.2.1 质粒转染 按常规方法将HEK293细胞进行培养。HEK293细胞胰酶消化后按每孔2.5×105细胞数接种12孔板孔中，用DMEM+10%FBS培养于37℃，5%CO2培养箱中。待细胞生长至70%-80%汇合时进行转染，细胞转染的具体操作按Lipofectamine2000说明书进行，转染后24小时换液。

1.2.2 免疫印迹 使用2×SDS Sample buffer 裂解细胞10min，超声5s×3次（无需100℃变性）。使用BCA蛋白定量试剂盒进行定量，取20μg总蛋白上样（20μg/孔）。根据分子克隆所示方法制备8%SDS-PAGE分离胶，5%堆积胶，以80V恒压电泳。290mA，转膜2h，封闭液（5%脱脂牛奶/PBS）封闭1小时。5%BSA/PBS稀释的Anti-GFP mouse antibody室温孵育1h（1：5000）。0.1% Triton X-100/PBS洗膜10min×2次。5%BSA/PBS 稀释的Anti-mouse IgG-HRP antibody室温孵育1h。0.1% Triton X-100/PBS洗膜10min×3次，按ECL说明书配制ECL液，孵育膜5min。暗室中显影。

1.2.3 ROS检测 转染24小时后，消化细胞，用培养基重悬，加入20μM DCF-DA（Sigma，D6883）置于37℃静置30分钟。DCF-DA标记后将细胞2000×g离心10分钟（，用培养基重悬，进行流式细胞仪（Beckman-Coulter MoFLo XDP cell sorter）分析。计算平均荧光强度。以空质粒对照组的平均荧光强度作为100%，计算相对值。以3次独立实验的结果进行统计。

1.2.4 流式细胞计数检测细胞凋亡 HEK293细胞进行转染24小时，使用2mg/ml的tunicamycin处理细胞12h，用常规方法将12空板中的每一孔培养细胞（约1×106/ml）重悬于DMEM+10%FBS培养基中；用PBS洗涤细胞二次（2000rpm离心5min）收集细胞；加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞；加入5μlAnnexin V-FITC混匀后，加入5μl Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应5-15min。1 消失内，进行流式细胞仪的观察和检测。用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488nm，发射波长Em=530nm。Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（FL3）检测。每个实验重复三次取平均值。

1.2.5 统计学分析 利用SPSS14.0统计软件进行分析。均数间的比较采用方差分析、独立样本t检验，数据以均数±标准差（χ±s）表示。P

2 结果

2.1 免疫印迹鉴定CX26野生型和Y155X突变体的表达 由于我们构建的质粒为突变CX26与myc标签融合质粒，因此可以采用myc的抗体来检测突变CX26的表达情况。由图1可见：野生型CX26和Y155X突变体都检测到了条带，且Y155X条带较野生型低，这表明蛋白已截短。

HEK293细胞中转染pCDNA3.1-CX26-Y155X-myc，pCDNA3.1-CX26 WT-myc质粒和空载体。Myc抗体检测CX26的表达。内参为actin。

2.2 CX26-Y155X导致ROS产生增多 为了探讨CX25突变体Y155X可能的致病机制，我们使用2’，7’-Dichlorofluorescin diacetate（DCFH-DA）检测细胞内ROS的水平。过表达Cx26-Y155X的细胞内ROS的水平显著高于过表达野生型Cx26的细胞和空载体细胞（图2）。而过表达野生型CX26与空载体组ROS水平无统计学差异。这表明，过表达突变体Y155X蛋白能导致细胞内ROS水平增加，可能导致细胞死亡。

HEK293细胞中转染pCDNA3.1-CX26-Y155X-myc，pCDNA3.1-CX26 WT-myc质粒和空载体。ROS水平以空载体组进行标化（100%）。CX26 Y155X组与空载体和WT组相比具有统计学差异。**：p

2.3 CX26-Y155X增加细胞对内质网应激诱导剂的敏感性 我们以前的研究结果显示，CX26-Y155X突变体聚集在内质网，可能导致内质网应激从而诱导细胞凋亡，我们在体外检测了加入内质网应激诱导剂tunicamycin后，细胞对药物诱导凋亡的敏感性，使用流式细胞技术方法检测细胞的凋亡改变。结果显示，加入tunicamycin后CX26 Y155X突变体对其敏感性增加，导致细胞凋亡。而野生型组和空载体组在该剂量诱导下，无明显的凋亡改变（图3）。

HEK293细胞中转染pCDNA3.1-CX26-Y155X-myc，pCDNA3.1-CX26 WT-myc质粒和空载体。加入Tunicaymcin处理后，检测细胞凋亡情况。control为溶剂组。CX26 Y155X组与空载体和WT组相比具有统计学差异。**：p

3 讨论

我们以前的研究CX26的某些突变（p.R32H、p.R143W、p.R165W、p.L214P、p.Y155X、p.L214P、c.631-632delGT、c.572delT、c.235delC、35del GT）散在分布于细胞浆中，不能定位到细胞膜形成功能性间隙连接斑。并聚集于内质网，且高尔基体无分布[5]。尤其是我们新报道的突变p.Y155X聚集于内质网，提示这个CX26突变蛋白失去了从内质网被转运的细胞膜的功能，其原因可能与突变导致CX26的蛋白构象发生改变有关，这种改变引起了内质网应激和未折叠蛋白反应，或者是突变蛋白不能与从内质网转运的细胞膜的微管系统结合，最终导致细胞运输障碍，甚至引起细胞死亡。异常突变蛋白的在内质网的聚集能导致未折叠蛋白反应引起内质网应激和引发细胞死亡[6]。

蛋白质在内质网中折叠的过程伴随着活性氧簇（ROS）的产生，细胞通过谷胱甘肽（GSH）来清除这一过程中生成的ROS。当大量突变蛋白合成后，其不能正确的折叠，在分子伴侣的作用下，错误形成的二硫键被打开而再次形成二硫键，此过程会造成过多的ROS生成，这是内质网来源的ROS[7]。另外，内质网应激时，线粒体来源的ROS也会增加，其机制尚未阐明，可能与内质网钙离子释放和线粒体摄取钙有关[8]。在本研究中，我们对内质网应激可能能产生的ROS进行检测，结果显示表达Cx26 Y155X的细胞ROS显著增加，同时也增加了对内质网应激诱导剂的敏感性。这些结果提示，CX26 Y155X突变体由于异常聚集于内质网从而导致内质网应激，诱导ROS产生增多，对环境因素诱导的内质网应激更加敏感，从而增加细胞的凋亡。对遗传性耳聋最重要的致病基因—CX26突变筛查和功能的深入研究，将有助于对可能患有先天性听力损害的胎儿进行产前咨询和产前诊断，对患者和家属给出尽可能多的建议。对CX26的研究也将帮助我们更好的了解其他间隙连接通道的功能，理解其在其他疾病中的发病机制。

参考文献

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