紫外可见分光光度法表征L―半胱氨酸对酪氨酸酶的作用机理

摘 要：本实验采用紫外可见分光光度法，研究了L-半胱氨酸对酪氨酸酶的作用机理。

关键词：紫外可见分光光度法 酪氨酸酶 L-半胱氨酸 失活动力学

中图分类号：Q356.1 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2014）07（c）-0091-02

酪氨酸酶（EC1.14.18.1）是一种含有铜金属的酶，并且是一种控制黑色素产生的限速酶。黑色素合成中，酪氨酸酶参与两种反应：在O2存在下酚羟基化催化合成邻二酚；邻二酚氧化为邻醌，随后邻醌通过一系列反应最终形成黑色素。酪氨酸酶广泛存在的植物和动物组织中，如切片的马铃薯暴露在空气中褐变，就是因为酪氨酸酶的存在。因此，酪氨酸酶抑制剂的应用在水果和蔬菜的保鲜上具有广泛应用空间。目前大多数研究主要是关于酶抑制剂的筛选和设计合成以及抑制黑色素合成的机制。在本文中，通过紫外可见分光光度法，研究了L-半胱氨酸对酪氨酸酶的作用机理。

1 实验方法

1.1 酶活测定

以L-DOPA作底物，30 ℃和pH6.8缓冲液条件下，恒温10分钟，随后加入不同浓度的L-半胱氨酸溶液和酪氨酸酶溶液，测定在475 nm处的吸光度（OD475）。

1.2 L-半胱氨酸与醌作用机理研究

分别将高碘酸钠（NaIO4）、邻苯二酚、L-半胱氨酸作用进行紫外全波长扫描；同样，将高碘酸钠（NaIO4）和邻苯二酚作用后进行紫外全波长扫描，考察L-半胱氨酸对邻苯二酚作用机理，高碘酸钠（NaIO4）、邻苯二酚化合物和L-半胱氨酸在各自体系中保持浓度为100 μmol/L。

2 结果与讨论

2.1 L-半胱氨酸对酪氨酸酶活力的影响

如图1所示，L-半胱氨酸浓度增大，酪氨酸酶与底物L-DOPA作用的能力下降，说明酪氨酸酶的活性受到了L-半胱氨酸的抑制，其抑制50%酶活力的L-半胱氨酸最低浓度（IC50）测得为52.0 μmol/L。在加入L-半胱氨酸后，出现了延滞效应。当L-半胱氨酸浓度为0时，不存在延滞效应，延滞效应出现在加入L-半胱氨酸后，并且L-半胱氨酸浓度增加而导致延滞时间的延长，当L-半胱氨酸浓度为100μmol/L时，延滞时间达到了284 s。

2.2 L-半胱氨酸与醌类化合物的相互作用

如图2所示，在紫外扫描波长为200 nm至500 nm范围内：曲线a为L-半胱氨酸全波长扫描，扫描后发现曲线a是一条平滑的曲线，无明显特征峰；曲线b为邻苯二酚全波长扫描，扫描后发现在275 nm附近有一邻苯二酚特征峰；曲线c为高碘酸钠和邻苯二酚作用后全波长扫描，扫描后发现在384 nm附近有邻苯二醌的特征峰，同时275 nm处的邻苯二酚特征吸收峰消失；曲线d为高碘酸钠（NaIO4）、邻苯二酚和L-半胱氨酸作用后，进行全波长扫描，发现384 nm处邻苯二醌的特征吸收峰消失，而275 nm的邻苯二醌的特征峰存在。图2说明了L-半胱氨酸与醌的亲核作用的产物的存在，并且在275 nm附近比邻苯二酚具有更强的紫外吸收特征峰。

2.3 L-半胱氨酸与醌类化合物的相互作用机理分析

如图2，L-半胱氨酸是含巯基的氨基酸，巯基具有强亲核作用，巯基能够迅速的与多巴醌反应，快速形成无色的多巴衍生物，从而阻断了醌向色素的转变，当反应体系的L-半胱氨酸全部消耗完毕，多巴醌才开始转化为多巴色素，这也说明了延滞时间的存在，并且延滞时间随着L-半胱氨酸浓度增加而延长。如图3所示，L-半胱氨酸可与L-DOPA的2，5和6位形成L-DOPA的衍生物。

3 结论

L-半胱氨酸对酪氨酸酶具有很强的抑制作用，50%活力下降所需的L-半胱氨酸浓度（IC50）为52.0 μmol/L。L-半胱氨酸后也出现了延滞效应，由于L-半胱氨酸快速的与醌反应，形成无色的多巴衍生物，并且延滞时间随着L-半胱氨酸浓度的增加而延长。