侧孢芽孢杆菌的耐热性实验

[摘 要]将湖北绿天地公司的侧孢样品分别用缓冲液、自来水和纯水稀释后，在80℃下处理，每五分钟取样检测其活菌数计算死亡率。结果显示湖北绿天地的侧孢芽孢杆菌产品是耐热的，在80℃水浴中处理60分钟，最高死亡率为50.4%。检测所用稀释介质影响死亡率，建议检测的稀释介质采用0.05M的磷酸缓释冲液（PH6.24）。

[关键词]侧孢芽孢杆菌；实验；耐热性

中图分类号：Q939.99 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2015）42-0335-02

1. 实验仪器和试剂

1.1 实验仪器：电子天平，电热恒温水浴锅（±1℃），WH-2微型漩涡混合仪，恒温冷冻摇床，超净工作台，隔水式电热恒温培养箱，高压灭菌锅。

1.2 实验器材：500ml三角瓶，250ml三角瓶，18*180试管，1ml刻度移液管，10ml刻度移液管，试管硅胶塞，培养皿（￠90），玻璃珠，100ml量筒。

1.3 实验试剂：蛋白胨（BR），牛肉膏（BR），葡萄糖（AR），琼脂条，40%NaOH，精密试纸PH5.5-9.0，Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），纯水。

2.实验方法与步骤

2.1 实验试剂的配制与用具准备

2.1.1 检测培养基配方：蛋白胨10克，牛肉膏5克，葡萄糖5克，琼脂条20克，1L纯水，PH7.0-7.2。

2.1.2 0.05MPBS溶液的配制：甲液：乙液1：4的比例配制（PH6.24左右）

甲液 0.05mol/L Na2HPO4 称取Na2HPO4 9.465g加水至1000ml。

乙液 0.05mol/L KH2PO4 称取KH2PO4 9.27Gg加水至1000ml。分装于棕色瓶放置于4℃冰箱。

2.1.3 分装包扎检测培养基 ，分别包扎培养皿，试管，刻度移液管及测样PBS，纯水及自来水（PH6.0左右），500ml玻璃珠三角瓶等。

2.1.4 将所有用具，培养基，检测用稀释介质等在高压灭菌锅内121℃保压30min，灭菌备用。

2.2 实验步骤

2.2.1 样品的预处理 分别称取待测样5-10g（精确0.0001g）3份于三个500ml带玻璃珠摇瓶内分别标记A、B、C。A中加90-95mlPBS，B中加90-95ml自来水，C中加90-95ml纯水。将三个玻璃珠瓶放置在恒温冷冻摇床上130r/min低于25℃条件下摇均匀待用。检测培养基完全溶化后放置在55℃水浴锅内保温待用。

2.2.2 分别测A，B，C的活菌数（以A为例，B、C测定方法相同）

2.2.3 样品稀释液的准备向20支无菌试管分别加入9mlPBS，试管上标记样品号和稀释倍数的字样，操作需在超净工作台上进行。

2.2.4 样品的稀释 吸取1.0ml试样悬液于第1支试管中，再从第1支试管中吸取1.0ml试样悬液于第2支试管中，依次进行10倍稀释到第6支试管（第6支试管需做两次重复），再从两个第6 支试管中分13次每次吸取1.0ml分别加到剩余13支试管中。（每次试样溶液稀释时，加样后的试管需在微型漩涡混合仪上震荡至少30-60s，再进行下一次操作。）

2.2.5 从已混合好的最后13支试管中取12支试管放入80℃水浴锅中水浴，在温度平衡后每5min取出一支试管冷却（至到第60min为止）。然后每只试管分别重新再在旋涡混合仪上混合均匀。第13支试管加样品悬液后不做热处理。用1ml无菌移液管从这13支试管中的每支试管中分别精确吸取1.0ml试样溶液加到一套无菌培养皿中，每支试管做4个培养皿，即4次重复。

2.2.6 取溶化好并保温在水浴锅中的培养基倒入每个培养皿10-15ml，并迅速将菌悬液与培养基混合均匀。平板在净化工作台上静置30分钟，待培养基凝固好后，置入37℃恒温培养箱内倒置培养48-72h。

2.3 计数

2.3.1 培养2-3天后取出计平板上的菌落数。

2.3.2 小于30或大于300个菌落的平板不作计数，为无效平板，需重做检测。

2.4 计算

2.4.1 试样中侧孢芽孢杆菌的芽孢数N=K*10n/M

2.4.2 死亡率（Q）的计算

3. 实验结果及讨论

3.1 实验结果

PBS、自来水、纯水分别稀释，80℃水浴每五分钟取样检测数据（两次以上检测数据）如下表：

纵轴为死亡率，横轴为水浴时间制备曲线图如下：

3.2 讨论

3.2.1 从图1明显看出用PBS作为稀释介质检测的死亡率比自来水和纯水处理的死亡率要低很多。

3.2.2 PBS稀释水浴后检测出现负值说明侧孢芽孢杆菌能耐热，且在那个水浴时间的分散效果比较理想。

3.2.3 PBS 最高死亡率出现在25min，死亡率为14.5%；自来水最高死亡率出现在20min， 死亡率为47.4%；纯水最高死亡率出现在25min，死亡率为50.4%。

3.2.4 PBS最低死亡率在35min，-23.2%；自来水最低死亡率在50min，18.45%；纯水最低死亡率在5min，18.9%。

3.2.5 自来水、纯水稀释死亡率相对都比较高，活芽孢数测定时建议不用自来水、纯水稀释湖北绿天地的侧孢芽孢样品。

3.2.6 在最高死亡率出现之后，检测死亡率又出现下降的原因分析：可能是因为试样颗粒在水浴过程中崩解并释放出颗粒内部的芽孢所至。

4.实验总结与意义

3.3 侧孢芽孢杆菌的耐热性质

3.3.1 侧孢芽孢杆菌在不同稀释介质中的耐热性不同。

3.4 实验意义

4.2.1 侧孢芽孢杆菌是一种天然菌种，安全无毒。它能分泌合成多种有机酸、酶、生理活性物质；能改善土壤微生态环境。对其性质特性研究非常有意义。

参考文献：

[1]赵云彤.侧孢芽孢杆菌HBL-26发酵条件的优化研究[J].黑龙江农业科学，2012，（5）：112-116.