揭秘化妆品安全性评价技术(二)

自从人们开始生产和使用化妆品以来，一直就有接触化妆品产生不良反应的报告。随着科学知识的不断增长以及公众对化学物质潜在危害的逐步认识和关心，一些国家制定了目的在于管制化学物质使用的法规，并建立了一套评价化学物质对人类不良反应的试验方法。因为从伦理上讲，既不能用人类做实验，又没有其它更好的方法，因而一直以来都理所当然采用动物实验进行毒理学安全性评价，以此类推对人体健康的危害。但是随着科学技术的进步，人们对待动物态度的变化和动物福利意识的高涨，科学研究中某些动物试验的方法也在适应这一趋势而发生变革。

一　什么是3R

实验动物作为人类的替身为人类的科学发展起到了不可替代的作用，随着科技的发展，生命科学研究领域实验动物使用数量猛增，实验动物的痛苦及其权利引起了社会公众的极大关注，特别是在西方动物保护运动的推动下。1959年拉舍尔和微生物学家伯可(Burch)在其著作《人道实验技术原理》(Principles of HumaneExperimental Technique)一书中第一次系统提出了3R(reduce，refine，replace)理论。之后，欧美各国成立了许多科学研究用动物福利的保护组织，如成立于1969年的英国医学试验用动物中替代法基金会(FRAME)和国际动物福利基金会(IFAW)，1980年成立的人道对待动物协会(PETA)，1981年约翰霍普金斯大学动物试验替代中心(CAAT)成立，这些基金会或研究机构的成立，推动了实验动物福利立法的进程，也促进新的科学研究方法的快速发展。

3R理论自形成以来一直影响着西方发达国家有关实验动物的法规，如美国的动物福利法案(1966年)，瑞士的动物福利法(1979年)。进入20世纪80年代后，欧美等发达国家动物福利法的发展进入快速发展的轨道，如英国的动物科学实验程序法案(1986年)，瑞典1988年公布实施了《动物福利法》(2002年修订)，丹麦1991年实施了《动物福利法》，1993年德国实施了《动物福利法》(1998年修订)，葡萄牙1995年公布实施了《保护动物法》，日本《人道对待和管理动物法》(2005年)。总的来说，欧洲大多数国家的动物福利保护立法是比较完备的，在世界上具有重要的影响。我国1988年了《实验动物管理条例》，科技部2006年了《关于善待实验动物的指导性意见》，在规范我国实验动物管理的同时，也顺应了国际对动物福利的要求，但我国还没有制定专门的动物福利法。

二　3R的含义

3R中减少的含义是指在科学研究中，使用较少的动物获取同样多的试验数据或使用一定数量的动物能获得更多试验数据的方法。如果某一研究方案中必须使用实验动物，同时又没有可靠替代方法选择，则应考虑把使用动物的数量降低到实现科研目的所必需的最小量。优化是指通过改善动物设施、饲养管理和实验条件，精心设计技术路线和实验手段，精炼实验操作技术，尽量减少实验过程对动物机体的损伤、减轻动物遭受的痛苦和应激反应，使动物实验得出科学的结果。优化的内容是比较广泛的，简单概括就是实验设计科学化、动物试验规范化和标准化的过程。替代是指一项试验方法能减少动物使用数量，或能优化试验程序以减轻动物痛苦或增加动物福利；或者能用非动物系统或者系统发生学上比较低等的动物种类代替高等级动物进行实验，如用无脊椎动物代替哺乳类动物。根据是否使用动物或动物组织，替代可分为“相对替代”和“绝对替代”，前者指使用脊椎动物细胞、组织及器官进行体外试验，或用低等动物替代高等动物的试验，而后者则是完全不使用动物，如采用培养的细胞或组织、计算机模型等。根据替代的程度，替代可分为“部分替代”和“完全替代”，前者指利用其他实验手段代替动物实验中的某一部分，后者指用新的非动物实验方法取代原来的动物实验方法。

对于化妆品安全评价中替代方法，可以选择体外培养物(细胞、组织或器官的培养物)代替实验动物、低等动物代替高等动物、人群研究资料、数学和计算机模型的应用，以及物理和化学技术的应用(如皮肤功能的测定)。可以说开发新的体外试验方法，减少、优化和替代动物实验既是保护动物权益的需要，也是科技进步和社会经济发展的需要。

三　欧盟化妆品安全性评价动物福利的背景

欧盟有关动物实验的法规体系由区域层次和国内层次两个体系组成，既有欧盟及其大多数成员国参加的欧洲条约，又有欧盟各国各自动物保护的法律规定，还有由政府部门和行业协会的管理规定和标准。

1986年3月18日，在法国的斯特拉斯堡通过了《用于实验和其他科学目的的脊椎动物保护欧洲公约》(European Conventionfor the Protection of VertebrateAnimals used for Experimental andother Scientific Purposes，CETSno.123)，该公约于1991年1月1日生效。公约旨在减少各成员国实验的次数以及使用动物的数量，鼓励成员国积极开展动物替代方法的研究，并仅在没有动物替代方法的情况下才用动物做实验。实验动物的选取应遵从明确的定量准则，并应得到良好的照顾，尽可能免受可避免的痛苦。

为了落实欧洲公约的要求，协调各成员国的国内立法，消除贸易壁垒，防止竞争出现扭曲，避免影响共同市场的建立和功能，欧洲共同体于1986年11月24日在布鲁塞尔颁布了《关于使各成员国有关用于实验和其他科学目的动物的保护法律、法规和行政规章接近的理事会指令》(即指令86／609／EEC)。指令正文和附件的规定与公约的规定基本一致。指令实施24年来，已成为欧盟范围内从事科学研究、检验用动物普遍遵守的准则。最新的报道指出，为了适应欧盟范围扩大和新的形势发展，如何使欧盟新成员国在实验动物福利方面协调一致成为立法者考虑的问题，2008年，欧洲委员会决定重新修订86／609／EEC指令。2010年9月8日，欧洲议会表决通过了新指令2010／63／EU，取代已实施25年了旧指令，成为保护实验用动物共同遵守的法律在欧盟27个成员国中得到实施，以规范每年在欧洲实验室超过1200万只动物的使用。BBC认为，随着2009年12月欧盟里斯本条约的推出，动物福利与反歧视、推动性别平等、保护人类健康和维护人类福利，共同成为欧盟的4个核心价值。新法规修订体现了以“3R”为中心的原则，具体涉及动物试验的伦理评估和建立持续的伦理审核制度，非人灵长类动物的使用，加强法规的透明度和执行力，加

强成员国之间动物伦理的合作等内容。新条款中也提到了相关的宗教规则，传统习俗和民族传统应该受到尊重。根据程序，各成员国转换为国内法的立法限期为2012年11月，各成员国法律条款的实施期限为2013年1月1日。

四　欧重化妆品安全性评价动物福利的要求

欧洲是唯一有法规禁止使用动物实验进行化妆品安全性评价的地区。众所周知，欧洲化妆品管理的法规是76／768／EC。1986年欧洲保护试验用动物的欧洲公约和理事会指令后，迫使药品、生物制品、化学品等与安全评价相关的行业执行这一共同的法律规定，化妆品行业也不例外，研发新的体外试验方法成为化妆品行业的一项重要任务。欧盟成员国先后成立了专门的研究机构，1989年，德国成为首个建立国家替代方法研究验证中心的国家。1990年欧盟在意大利成立了欧洲替代方法验证中心(ECVAM)，专门从事替代方法的验证和法规认可工作。欧洲化妆品、盟洗用品和香水协会(COLIPA)建立了动物实验替代方法委员会(SCAAT)，以执行法律的规定和保障化妆品工业的发展，接受应用非动物的替代方法进行化妆品安全性评价。各大公司投入巨额经费从事替代方法的研究。欧洲框架计划也投入巨额研发经费资助非动物试验方法的研发，一大批新的化妆品毒理学安全性评价的体外试验方法被提出，进入科学验证程序和被法规接受。科学家和管理者逐步认同不再信赖于动物实验的新的毒理学试验体系。

在技术进步的推动下，2003年，欧委会通过了关于76／768／EEC的第七次修订，即2003／15／EC指令，该指令明确了取消动物实验的时间表。指令明确规定自2009年3月11日起，禁止使用动物进行化妆品急性毒性、眼刺激和过敏试验，2013年将全面禁止在动物身上进行化妆品和原料的安全性测试，也不允许成员国从外国进口和销售违反上述禁令的化妆品。该规定对欧盟内部成员国和非欧盟国家进口的产品的要求是一致的。

这一指令的出台，可以说是在欧洲范围内，将动物福利和3R的原则从最初的理念(1959年)，到立法约束(1986年)、再到技术进步(2003年)，再到最后形成法律禁令(2009年)，稳步推进分步实施。客观上形成了技术壁垒，影响到化妆品的进出口贸易。为了进一步明确2003／15／EC指令的要求和提高可操作性，2006年6月7日欧盟委员会颁布了《依照76／768／EEC没有使用动物实验的声明指引》(即2006／406／EC)。指引规定，对不使用动物试验的化妆品，其产品制造商或负责产品投放市场信息的个人(商)，可以声明其产品没有经过动物试验。这一声明不是强制性的。对于“非动物试验”的标签声明的使用不能误导消费者，消费者能从知情的选择中获得真实的利益。该声明的使用不应导致以该类声明作为市场手段的生产商和(或)供应商之间不公平的市场竞争。

2009年12月，欧盟了新的化妆品法规1223／2009／EC，在过度期后将取代指令76／768／EC成为欧洲的化妆品统一法律。该法律保留了原指令对动物试验禁令的规定，进一步明确3R的原则，列为第五章第18条，同时对禁止动物试验的情形和豁免条件作出了规定。

五　美国化妆品法规对动物福利的要求

1976年和1980年，在美国动物福利协会(AWI)、动物联合行动组织(UAA)和动物保护协会的共同努力下，《动物福利法》(制定于1966年)和《人道主义饲养和使用实验动物的公共卫生方针》重新修订。通过这两个法规性文件，使3R在动物实验方面的应用得以落实。另外，修订的《动物福利法》还规定了减少动物痛苦的标准，并要求研究者在可能引起实验动物痛苦时考虑替代方法。1981年，CAAT成立，1986年美国国会提出了关于在研究、检验和教育中动物应用替代物的技术评估报告。1993年CAAT作为东道主举办了第一届生命科学中替代物和动物应用世界大会。在美国，许多国家部门的工作中渗透了动物替代实验的原则。1993年，一个由多部门参与的组织，替代方法验证跨部门协调委员会(ICCVAM)成立。ICCVAM由15个联邦管理和科研机构组成，包括消费者产品安全委员会、农业部、国防部、能源部、内政部、交通部、环保局、食品药品管理局、国立癌症研究所、国立环境卫生科学研究所等联邦机构。其主要职责是技术协调和评估新的和修订的实验方法。到目前为止，经ICCVAM评估验证的体外方法涉及许多安全评价终点，包括急性经口毒性、发育毒性、内分泌紊乱、眼腐蚀／刺激、遗传毒性、热原试验、皮肤腐蚀和皮肤敏感性。

在化妆品行业，20世纪70年代美国动物保护主义者抗议使用动物进行试验，强烈抨击化妆品毒性鉴定中的眼刺激试验和急性毒性试验使动物遭受痛苦、损伤甚至不正常死亡。世界知名的Revion化妆品公司被迫与动物保护者谈判，同意提供250万美元资助洛克菲大学研究Draize眼刺激试验的替代方法。1980年，美国化妆品、盟洗用品和香水协会(CTFA)共同赞助成立了CAAT专门致力于替代方法的研究。1993年，美国的“动物权利法”强制研究单位建立“伦理考察委员会”，鼓励化妆品公司和研究单位开展动物替代方法和优化试验程序的研究，同年美国国会成立了ICCVAM和机构间替代方法管理小组(IRAG)，后者由美国FDA、环境保护局(EPA)和消费品安全委员会(CPSC)为代表，早期开展了一个三年研究计划(1991－1994)，从41个实验室29个不同试验方法得到的60个实验数据评价眼刺激替代试验方法的有效性。进入21世纪，美国替代方法的研究、验证以及认可进程明显加快。

六　国际社会对动物试验替代技术的认可

2002年，OECD正式成立了动物保护国际委员会(ICAPO)，许多非政府组织、企业界和环保界的代表共同参与。欧洲、美国和日本等主要国家统一在OECD的框架内发挥各自作用，在化学测试指南中倡导有关实验动物保护的建议。ICAPO成立以来，替代方法的验证和认可明显加快，从2002年起已有10多项替代方法被认可，2009年新的健康和环境评估的替代／优化方法多达9项，2010年重新和修订的方法超过6项。在方法验证和认可方面，上世纪90年代初，国际社会对于替代方法的验证还存在争论，虽然当时OECD内部没有成立专门的替代验证机构，但在积极协调成员国的立场和推动全球范围内的替代方法认可方面做了大量工作。2005年，OECD制订了替代的验证和认可指南，2004年和2007年，OECD还分别提出了(Q)SAR模型的验证指南。2007年在加拿大召开了由欧洲、美国和日本参加的化妆品法规国际协调会议(International Cooperationon Cosmetic Regulation，ICCR)，推动替代方法的国际合作和促进3R的发展。

到目前为止，化妆品安全评价方面，通过有效性验证的动物替代方法有急性毒性试验、皮肤腐蚀性／刺激性试验、眼刺激性／腐蚀性试验、皮肤光毒性试验、皮肤光敏感性试验、皮肤渗透试验和生殖毒性试验，有的方法并已收入OECD化学物质试验指南中。

纵观3R理念提出50年来在化妆品毒理学领域中动物试验替代方法的发展轨迹，大致可分为三个阶段。1986年以前是立法接受的阶段，欧洲公约的使包括化妆品在内的各行业在科学研究的动物试验中执行动物福利的原则提高到了法律的层次，从此，欧洲的替代方法研究从民间的自发行为，正式成为政府工作职责的一部分。1986年到2009年是科技进步推动3R原理从理念到现实的阶段，许多现代科技手段在毒理学评价试验中得到应用，如细胞培养、组织工程技术、基因组学、高通量筛查技术和计算机模型，带来了检验标准的更新和法规管理的变革。2009年以后，(至少在欧盟范围内)化妆品动物试验禁令正式生效，它给欧盟以外的其它国家带来的不仅是化妆品贸易受阻和检验技术壁垒，更多的是适应这一壁垒的技术进步和观念更新。只有顺应这一趋势，提高化妆品安全评价技术的现代化水平，才能保障我国化妆品进出口贸易和安全检测技术的健康发展。