可注射性荧光水凝胶用于抗癌蛋白质药物控制释放的综合实验设计

摘要：高分子水凝胶的制备、性能表征和应用是大学材料化学和生物药学专业学习的重要内容。设计水凝胶制备的综合实验对培养大学生学习兴趣、科技创新能力和独立解决问题能力具有十分重要意义。本文主要设计一个新型的基于光控“点击化学反应”的可注射性荧光水凝胶的教学综合实验。详细介绍了可注射性荧光水凝胶的制备方法、流变分析和在抗癌蛋白质药物控制释放中的应用。本综合实验设计新颖、方法可行性高、实验现象明显、应用性强，必能很好地用于大学生实验教学。

关键词：水凝胶；流变分析；药物控制释放；抗癌蛋白质药物；教学实验

中图分类号：G424.31 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2014）08-0249-02

一、引言

高分子水凝胶（hydrogel）是一种能够在水中溶胀，吸收并保持大量水分而又不溶解于水的三维聚合物溶胀体。高分子水凝胶网络中可以充斥大量的水分，结构上与机体组织相似，具有良好的生物相容性和尺寸可调节的多孔结构，现已被广泛地用于隐形眼镜、人工皮肤、人工角膜、人工软骨组织等领域。水凝胶具有优良的生物学性质以及理化性质，如生物粘附、生物相容以及生物降解性能，可以应用在缓释、脉冲释放、触发式释放等新型给药系统的研制中，也就说可以将其应用在可控药物的释放中。

二、实验原理

本实验将制备一种新型的基于光控“点击化学反应”的可注射性聚乙二醇水凝胶。通过调节光辐射的时间和位置，可以制备得到各种图案化的荧光水凝胶。该水凝胶制备方法有机结合了光聚合和“点击化学”的长处，既有高效、快速和专一的特点，又有光聚合的时空可控性，同时无需任何毒性催化剂和引发剂，十分有利于蛋白质药物的包裹和控制释放。

三、仪器与试剂

1.实验仪器。恒温水浴锅、流变仪、粗天平、电热干燥箱、锥形瓶、烧杯、干燥管、减压抽吸泵。

2.实验药品。苯胺（Alfa Aesar），三乙胺（TEA，Aldrich），对甲酰基苯甲酸（98.0%，TCI），四臂的聚乙二醇（PEO-4-OH，Mn=10 k，PegBio Co.，Ltd），甲基丙烯酸酐（MA，Merck），苯环酰肼（98.0%，TCI），N，N-二环己基碳二亚胺（DCC，99%，Alfa Aesar），4-二甲氨基吡啶（DMAP，99% Alfa Aesar），二氯甲烷（CH2Cl2）用氢化钙（CaCl2）干燥回流使用；细胞色素C购买后直接使用；甲苯用钠丝干燥回流后使用，所需试剂均为分析纯。

四、测试与表征

1HNMR使用Unity Inova 400型共振波谱仪测定，选用氘代氯仿（CDCl3）、氘代二甲亚砜（DMSO-d6）为溶剂，将溶剂峰的化学位移作为参考标准。凝胶模量与凝胶时间用哈克RS6000（Thermo Scientific）流变仪测试，间距为0.5mm，温度为37℃，频率为1Hz，剪切应变为1%。流变仪上配置UV引发装置，光强有10.0 mW/cm2、20.6 mW/cm和30.7 mW/cm2三个等级，激发的波长在365±5nm左右[1]。紫外UV暗箱，激发波长在365±5nm左右，光强为60.0 mW/cm2。

五、实验步骤以及注意事项

1.四唑（Tet）小分子的合成。在通入氮气的保护条件下，在100mL两颈瓶中进行进行操作，再50mL乙醇中取0.75g（5mmol）对甲酰基苯甲酸充分溶解，然后加入0.86g （5mmol）苯磺酰肼，溶解充分后，再搅拌0.5h，再用二次水沉淀法，干燥，得到淡黄色固体苯腙1.2975g，产率达到85.4 %。将0.23mL苯胺溶于水、乙醇、浓盐酸三者混合溶液中，其中有2mL水、2mL乙醇、0.65mL浓盐酸，在冰水水浴条件下，在1ml二次水中溶解0.175gNaNO2固体，完全溶解后逐滴将其加入到上述混合溶液中，搅拌15min，得到淡黄色的重氮苯溶液。在15ml吡啶溶解0.6g苯腙，充分溶解后，逐滴将其加入到上述淡黄色的重氮苯溶液中，反应温度控制在0℃，反应6h，得到红棕色的溶液，用乙酸乙酯对该溶液进行4次萃取，每次取10ml，分离得到有机相，之后再加入120ml，3MHCl进行萃取分层，取上层的有机层，通过过滤、真空干燥得到0.206 g粉红色的固体，产率达到39.4%。

2.四臂的聚乙二醇的四唑衍生物（PEG-4-Tet）的合成。在通氮气的保护下，将0.216g四唑充分溶解于15ml二氯甲烷中，然后加入120mgDCC，充分搅拌15min。将10K，0.5 gPEG溶解于2mL二氯甲烷中，然后加到上述四唑溶液中，混合搅拌10min后再加入10mgDMAP，充分反应24h，之后过滤，用冰乙醚沉淀，干燥后得到产物0.421g，产率为90.4%。

3.四臂的聚乙二醇甲基丙烯酸酯衍生物的合成。在通入氮气的保护下，向25mL密封反应器中加入四臂聚乙二醇0.5g，120μL三乙胺Et3N，240μL甲基丙烯酸酐，4.9mgDMAP，10mL甲苯，将反应器密封好，置于70℃油浴中反应24h，之后用冰乙醚沉淀过滤，在常温下真空干燥得产物0.45g，产率为60.5%。

4.水凝胶的制备和流变分析。水凝胶按如下方法制备：分别将一定的PEG-4-Tet（DS81.6%）和PEG-4-MA溶于PB（200μL，pH7.4，10mM）中制备得到浓度分别为20wt%或30wt%的溶液，在室温下将两种溶液充分、均匀混合，置于波长365nm的紫外灯下，照射10min形成凝胶。通过使用遮光模板先盖住聚合物溶液，然后再用紫外光辐射可以制备得到设计图案的水凝胶，这些图案可以用荧光显微镜观察并拍照2]。采用RS6000流变仪（Thermo-Fisher，Germany），在37℃下Φ20mm的测试平台上进行流变分析操作。将PEG-Tet和PEG-MA的PB混合溶液加到测试平台上，然后在在液体表面滴加少量的油防止测试过程中水分的挥发。测试得到储能模量（G′）和损耗模量（G″）随时间变化的关系图。水凝胶的凝胶时间定义为从测试开始到G′= G″时所耗费的时间。

六、结果与讨论

本综合实验设计新颖、方法可行性高、实验现象明显以及应用价值较高。同时，实验教学在反应条件以及测试方法等方面进行了较大的改进，实验现象明显，可以保证试验教学的成功率；另外在保护环境、节约药品以及控制教学时间等方面也取得较为理想的结果。

参考文献：

[1]田帅.聚乙二醇、聚乙烯醇改性双网络水凝胶的制备与表征[D].杭州：浙江大学，2010.

[2]陈欢欢，昝佳，林莹，蒋国强，丁富新.壳聚糖/聚乙烯醇温敏水凝胶的制备及性质研究[J].清华大学学报（自然科学版），2006，（06）：93-96.

[3]张启凤.羟丙基壳聚糖及其水凝胶的理化性能和药物缓释应用研究[D].青岛：中国海洋大学，2003.