Zn对AM真菌侵染紫云英转化根的影响

摘要：分别建立丛枝菌根（ＡＭ）真菌Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ、Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｒｏｓｅａ和Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ与紫云英转化根双重共培养体系，并利用该体系研究不同Ｚｎ浓度对单接种与混合接种ＡＭ真菌侵染紫云英转化根的影响。结果表明，０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ提高了大部分处理的根段侵染率、菌丝密度以及Ｐ的吸收，０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ抑制了ＡＭ真菌菌丝的生长，但能增加部分处理转化根对Ｐ的吸收。０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ浓度下，单接种Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ、混合接种Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ与Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的根段侵染率最高，并且在混合侵染根段中Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ根段侵染率比Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ高１２％。

关键词：丛枝菌根（ＡＭ）真菌；转化根；共培养；Ｚｎ；Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ

中图分类号：Ｑ９３９．５；Ｑ９３５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）04－0685-05

丛枝菌根（ＡＭ）真菌是一类与植物专性共生的真菌，能与８０％以上陆生维管植物形成互惠共生体，促进植物吸收矿质营养，增强植物抵抗逆境胁迫及病害的能力［１］。ＡＭ真菌营专性共生生活，至今尚未实现离体纯培养。传统的盆栽培养方法费时费力，无法避免外来细菌与真菌的污染，无法避免土壤缓冲和固结等干扰因素，只能进行生理学与形态学观察。相对意义的离体纯培养经历了植物正常根系与ＡＭ真菌、植物转化根系与ＡＭ真菌双重共培养两个阶段。植物转化根与ＡＭ真菌双重共培养体系的优点是能够提供纯净、没有污染的任何生长阶段的ＡＭ真菌研究材料［２，３］，并且转化根生长旺盛，缩短了ＡＭ真菌与宿主建立共培养体系的时间，比起传统盆栽材料，更适合做形态学、超微结构、生理学、生物化学和分子生物学上的研究，为菌种鉴定和描述提供了可靠材料［４，５］。

Ｚｎ是植物体必需的微量元素，但是高浓度的Ｚｎ却有毒害作用，可能引起氧化性损伤［６，７］。而ＡＭ真菌的某些蛋白质参与抗氧化反应的调节，能有效缓解Ｚｎ的氧化压力和毒性［８］。此外，ＡＭ真菌通过增加自身生物量、根内和根外菌丝量来增加对Ｚｎ的固定或者分泌金属螯合物如蛋白质球囊霉素来缓解Ｚｎ对植物的毒害［９］。

本研究拟在平板上建立ＡＭ真菌与转化根共培养体系，研究不同Ｚｎ浓度对３种ＡＭ真菌单接种或双接种侵染紫云英转化根以及吸收Ｐ、吸收Ｚｎ的影响，为在分子水平上研究ＡＭ真菌的抗Ｚｎ机制提供有利的技术平台。

１材料和方法

１．１材料

ＡＭ真菌Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ，Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｒｏｓｅａ来自法国，为盆栽培养所得接种剂；Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ为与胡萝卜转化根培养所得，由法国农业科学院（ＩＮＲＡ）Ｖｉｖｉｅｎｎｅ Ｇｉａｎｉｎａｚｚｉ－Ｐｅａｒｓｏｎ教授惠赠；紫云英（Ａｓｔｒａｇａｌｕａ ｓｉｎｉｃｕｓ Ｌ．）、发根农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｓ）Ｋ５９９由华中农业大学微生物学国家重点实验室生物固氮室提供。

１．２方法

１．２．１特异性引物的设计分别抽提３种AM真菌孢子的ＤＮＡ，用真核生物通用引物ＬＲ１和ＮＤＬ２２扩增核糖体25S ｒＤＮＡ序列，ＬＲ１的序列是：５′－ＧＣＡＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＣＧＧＡＧＧＡ－３′，ＮＤＬ２２的序列是：５′－ＴＧＧＴＣＣＧＴＧＴＴＴＣＡＡＧＡＣＧ－３′［１０］，得到的片段大小为７５０ ｂｐ，将ＤＮＡ条带回收纯化，转化到大肠杆菌ＤＨ５α中，取阳性菌菌液测序，得到序列后进行比对，设计特异性引物并进行验证。

１．２．２接种ＡＭ真菌和紫云英转化根共培养参考并改进Ｃｈｏ等［１１］的方法诱导转化根：选取颗粒饱满大小均匀的紫云英种子，用体积分数为７５％的乙醇溶液处理８ ｍｉｎ，无菌水冲洗５次，用体积分数为３％的次氯酸钠溶液表面消毒１０ ｍｉｎ，无菌水漂洗５次以尽可能除去种皮表面残留的次氯酸钠。将种子浸在无菌水中，置于２８ ℃培养箱中充分吸涨，平铺于含５ ｇ／Ｌ蔗糖的琼脂平板上，置于光照培养箱（１６ ｈ／ｄ，２２～２５ ℃）培养５～７ ｄ，取子叶展开的无菌幼苗，用解剖刀将下胚轴中部切断，弃根，将紫云英幼苗伤口处浸没于培养至对数期的发根农杆菌Ｋ５９９菌液中，浸泡１５ ｍｉｎ，取出放于无菌滤纸上，吸干子叶表面所带菌液，将幼苗置于含ＭＳ培养基［１２］的平板光照培养。３ ｄ后将带有发根农杆菌Ｋ５９９的幼苗转入含有卡那霉素（４０ μｇ／ｍＬ）和羧苄青霉素（５０ μｇ／ｍＬ）的ＭＳ培养基中除菌并诱导发根。３周后紫云英幼苗愈伤组织处长出转化根，剪下约５ ｃｍ根尖，转接到与ＡＭ真菌双重共培养所用ＭＳＲ培养基［１３］上，用含有抗生素与不含抗生素的ＭＳＲ培养基间隔除菌，直至将转化根所带发根农杆菌Ｋ５９９除净，经ＧＵＳ染色验证，最后获得生长旺盛的无菌紫云英Ｒｉ Ｔ－ＤＮＡ转化根。

用移液器分别吸打６个表面已经灭菌的孢子铺于ＭＳＲ培养基上。５ ｄ后，在孢子萌发良好、未见污染的皿内添加５条生长旺盛的约５ ｃｍ长的紫云英转化根，２６ ℃暗培养，每周取样检测各菌种侵染率。

１．２．３混合接种ＡＭ真菌和紫云英转化根共培养设计两种接种方式：Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ与Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ，Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ与Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ。各菌种按孢子个数比１∶１接种，总共６个表面消毒的孢子铺于ＭＳＲ培养基上。其他操作同１．２．２。

１．２．４Ｚｎ对ＡＭ真菌侵染紫云英转化根的影响配制Ｚｎ浓度为０（正常培养基中Ｚｎ含量）、０．１、０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＭＳＲ培养基，按照前面提到的方法建立共培养，设置６种接种方式，３个单接种，２个双接种，１个不接种，共１８种处理，每种处理８个重复，８周收获，用Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色法和Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ法检查根段侵染率，显微摄像法测量菌丝密度，原子吸收光谱分析法检测根中Ｚｎ浓度，钼锑抗比色法检测根中Ｐ浓度等指标。

２结果与分析

２．１特异性引物的验证结果

将３种孢子的２５Ｓ ｒＤＮＡ测序结果进行多序列比对设计了Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ的特异性引物Ｇｉｇ．ｍ－Ｆ：５′－ＣＧＴ ＣＡＡ ＣＧＴ ＣＣＴ ＴＡＡ ＴＧＡ ＡＴＴ ＴＡＴ Ｇ－３′，Ｇｉｇ．ｍ－Ｒ：５′－ＧＡＴ ＡＣＧ ＴＴＴ ＴＴＧ ＡＣＧ ＴＴＣ ＴＧ－３′（５６６ ｂｐ）。Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ的特异性引物对为ＬＲ１/２３．２２（６３０ ｂｐ），其中，２３．２２：５′－ＧＡＡ ＴＣＡ ＣＡＧ ＴＣＡ ＧＣＡ ＴＧＣ ＴＡ－３′［１０］， Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的特异性引物对为ＬＲ１/８．２２（４５５ ｂｐ），其中，８．２２：５′－ＡＡＣ ＴＣＣ ＴＣＡ ＣＧＣ ＴＣＣ ＡＣＡ ＧＡ－３′［１０］。为了验证３种引物对的特异性，取这３种孢子ＤＮＡ和紫云英根段ＤＮＡ进行Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ扩增。第一轮所用引物对为ＬＲ１／ＮＤＬ２２，第二轮ＰＣＲ分别使用特异性引物对Ｇｉｇ．ｍ－Ｆ／Ｇｉｇ．ｍ－Ｒ、ＬＲ１／２３．２２、ＬＲ１／８．２２，电泳结果显示，Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ的引物对Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和紫云英具有特异性，Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ的引物对Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ和紫云英具有特异性，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的引物对Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ、Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ和紫云英均具有特异性（图１）。

２．２紫云英转化根的成功诱导和性状

紫云英转化根从愈伤组织处长出，无向地性，颜色较白，分枝多，生长旺盛，激素自养。由于转入了发根农杆菌K599的卡那霉素抗性基因和ｇｕｓ基因，可以在４０ μｇ／ｍＬ的卡那霉素下生长，并能够被ＧＵＳ染成蓝色，正常根仍然是白色（图２）。

２．３共培养体系的建立以及成熟孢子的产生

各菌种在培养过程中孢子萌发管伸长，侵染紫云英转化根，Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ和Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ产生辅助细胞和丛枝，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ产生泡囊和丛枝等特殊结构。Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ在第一周就有侵染，之后根段侵染率迅速增加，到第五周时达到４５％，之后趋于平稳；Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ侵染较慢，两周时才发现侵染，第五周时根段侵染率达到２２％，之后趋于稳定，根段侵染率最低；Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在最初的四周根段侵染率较低，但是稳定增长，到第六周时达到５１％，在３个菌种中根段侵染率最高（图３）。各菌种均产生了成熟孢子，Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ大约６周时产孢，新生孢子经低温处理后可以萌发并再次侵染紫云英转化根；Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ大约８周时产孢，但新生孢子未见萌发；Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ大约５周时产孢，新生孢子无需低温处理直接萌发并侵染紫云英转化根，连续产生５代新生孢子（图４）。混合接种处理中每个种均侵染转化根，并产生成熟子代孢子。

２．４Ｚｎ对ＡＭ真菌侵染紫云英转化根的影响

取各种处理的根段进行Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色检测侵染率（图５），结果显示在３种Ｚｎ浓度下，单接种的侵染率Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ＞Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ＞Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ，０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ提高了各种处理的根段侵染率，其中，单接种Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ、混合接种Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ与Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的根段侵染率最高，Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ与Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ双接种的根段侵染率介于两个单接种根段侵染率之间；当Ｚｎ浓度为０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ时，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ受Ｚｎ抑制较明显，根段侵染率降低了４６％，Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ与Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ双接种处理的根段侵染率最高。为了进一步探讨双接种中各菌种的侵染情况，采用Nested PCR法，用种特异性引物分别扩增混合侵染根段，得到各菌种对混合侵染根段的侵染率（图６），发现在Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ与Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ双接种处理中，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在Ｚｎ浓度为０、０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ时比Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ根段侵染率高，在混合侵染根段中占优势地位，０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｚｎ浓度时，Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ根段侵染率比Ｇｉｇａｓｐｏｒａ ｍａｒｇａｒｉｔａ高１２％，但是０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的Ｚｎ对Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ抑制较明显，两者根段侵染率几乎持平；在Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ 与Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ双接处理中Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的根段侵染率总是最高的。

从表１可见，随着培养基中Ｚｎ浓度的增高，根内的Ｚｎ浓度也随之升高，在Ｚｎ浓度为０时，接种了ＡＭ真菌的处理比不接种的Ｚｎ浓度高，当Ｚｎ浓度为０．１或０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ时，接种ＡＭ真菌降低了根中Ｚｎ浓度；Ｚｎ浓度为０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ时，除了ＲＩ和ＮＭ，各处理的菌丝密度都有显著增加，除了ＭＩ和ＲＩ，各处理的Ｐ的吸收也有增加；Ｚｎ浓度为０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ时较大程度抑制了真菌菌丝的生长，菌丝密度下降，但是根内Ｐ浓度略有上升。

３小结与讨论

由发根农杆菌K599诱导得到的Rｉ Ｔ－ＤＮＡ转化根具有生长迅速、激素自养、生长条件简单以及分化程度高、不易变异等特点。ＡＭ真菌和离体转化根共培养体系的建立，丰富了ＡＭ真菌在分类学以及系统发育上的研究［５］。它能直观地提供纯净的、没有污染的任何生长阶段的ＡＭ真菌研究材料［２，３］，比起传统盆栽材料，它更适合做形态学、超微结构、生理学、生物化学和分子生物学上的研究，为菌种的鉴定和描述提供了可靠的材料［４］。

本试验中，各菌种根段侵染率都比盆栽培养所得到的根段侵染率低，这可能由于双重共培养所用培养基含有高浓度无机盐和碳水化合物，碳水化合物通过根表皮细胞直接渗透到根内皮层细胞里，而不是像正常植物那样通过光合作用获得，影响了植物细胞和ＡＭ真菌共生的化学平衡［５］，因而ＡＭ真菌与植物的共生结构数量减少，根段侵染率降低。

Ｚｎ浓度为０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ时大部分处理比不加Ｚｎ处理中的根外菌丝密度大，根中Ｐ含量也高，可能是ＡＭ真菌通过增加根外菌丝生物量来稀释植物体或菌丝内的Ｚｎ浓度，并且吸收更多的Ｐ来缓解Ｚｎ对根和本身的抑制作用，这与Ｓｍｉｔｈ等［１４］所得到的结果一致。Ｚｎ浓度为０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ时ＡＭ真菌的生长受到抑制，根段侵染率显著降低，这与Ｃａｖａｇｎａｒｏ等［１５］的盆栽试验所得到的结论并不一致，可能是因为盆栽试验所用土壤成分比较复杂，对Ｚｎ的缓冲能力较强，而培养基的缓冲能力比较差所致。

在所有的接种处理中，Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ对转化根的促生效应比较明显，与Ｇｉｇ． Ｍａｒｇａｒｉｔａ或Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ混合接种时表现出较强的竞争优势，但是对高浓度Ｚｎ的抗性较差。Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ与Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的双接种处理根段侵染率较高，Ｐ吸收较大，根外菌丝密度较大，比单接种Ｇｉｇ． ｍａｒｇａｒｉｔａ的效果好，与单接种Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ的效果相似；Ｇｉｇ． ｒｏｓｅａ与Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ双接种处理各项指标都介于两个单接种之间，并没有产生混接优势。Ｊａｎｓａ等［１６］报道，Ｇｌｏｍｕｓ ｍｏｓｓｅａｅ，Ｇｌｏｍｕｓ ｃｌａｒｏｉｄｅｕｍ和Ｇｌｏｍｕｓ ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ单接种、双接种或三接种时，只有Ｇ． ｃｌａｒｏｉｄｅｕｍ与Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ双接种的根段Ｐ浓度比单接种时高，产生功能互补，其他双接种或三接种都没有功能互补效应。Ｇ． ｉｎｔｒａｒａｄｉｃｅｓ在双重共培养体系中根段侵染率最高，接近盆栽试验的根段侵染率，而且侵染快、产孢多，并且能够连续产孢，是利用双重共培养体系研究ＡＭ真菌与宿主植物相互作用的理想菌种。