金丝草总黄酮大孔树脂纯化工艺优化

摘要：比较了5种大孔树脂对金丝草（Pogonatherum crinitum）中总黄酮的吸附及解吸性能，采用静态和动态的吸附-解吸试验，利用紫外可见分光光度计测量金丝草总黄酮的浓度，研究不同的工艺条件对总黄酮纯化的影响。结果表明，静态分离纯化工艺的最佳参数为DA-201大孔树脂质量与吸附液体积的比值1∶10（m/V，g∶mL）、吸附液pH 3.00、恒温振荡时间3 h、解吸液为70%的乙醇溶液。动态分离纯化工艺的最佳参数为采用2 mL/min流速上样，用3个柱体积的70%乙醇，以2 mL/min流速洗脱可较好地分离纯化金丝草总黄酮。

关键词：金丝草（Pogonatherum crinitum）；总黄酮；纯化；DA-201大孔树脂

中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）10-2393-04

金丝草（Pogonatherum crinitum）又名落苏、猫尾草、猫毛草等，为禾本科金丝草属植物金丝草的干燥全草。文献记载金丝草性寒，无毒，具有清热、解暑、利尿之功效[1]。金丝草资源十分丰富，含有多种活性成分，其中主要的活性成分为黄酮类化合物[2，3]，而黄酮类化合物具有多种生物活性。近年来掀起了黄酮类化合物研究、开发利用的热潮，促使其在化妆品、医药、食品等工业中有广泛的应用[4]。因此将金丝草总黄酮高效、快速地提取分离出来，并通过纯化得到一定纯度的产品，具有很高的经济价值与现实意义。且目前对金丝草总黄酮的研究甚少，尚未发现有对其进行纯化工艺的研究报道。本研究采用大孔树脂分离纯化金丝草总黄酮，对5种大孔树脂进行了筛选，并研究金丝草总黄酮的分离纯化工艺，为金丝草的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂 金丝草购于潮州市南桥市场，洗净，自然晾干，于60 ℃烘干，研碎过40目筛，备用；所有试剂均为分析纯；FL-1、FL-2、FL-3、AB-8大孔树脂购于天津欧瑞生物科技有限公司；DA-201大孔树脂购于西安朴天吸附材料有限公司。

1.1.2 仪器与设备 752S型紫外可见分光光度计购于上海棱光技术有限公司，BT-100B型数显恒流泵购于上海泸西分析仪器厂，ET-Q型气浴恒温振荡器购于常州荣冠实验分析仪器厂等。

1.2 方法

1.2.1 标准曲线的绘制 参照文献[5]中的方法，以吸光度（A）为纵坐标，芦丁浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，得芦丁标液浓度（C）与吸光度（A）标准曲线的线性回归方程式为：A= 9.031 8C-0.004 0，r=0.998 9。

1.2.2 金丝草总黄酮提取液的制备及浓度测定 准确称取已烘干粉碎的金丝草样品5.0 g，加入100 mL石油醚回流除去色素后烘干，并用100 mL 60%的乙醇浸泡过夜，然后用超声波辅助提取两次，减压抽滤得到萃取液并定容至250 mL备用。按照绘制标准曲线的方法测定总黄酮浓度。

1.2.3 大孔树脂的预处理 将5种大孔树脂用80%的乙醇浸泡过夜，洗涤至洗涤液无乳白色，再用去离子水洗去乙醇至洗涤液无醇味，备用[6]。

1.2.4 大孔树脂的筛选 精确称取经预处理过的5种干树脂各1.0 g，分别装入50 mL锥形瓶中，各加入总黄酮浓度为0.780 6 mg/mL的样品溶液10 mL。由于黄酮类化合物为多羟基酚类，呈弱酸性，因而要达到较好的吸附效果，必须在弱酸性条件下吸附[7]，试验吸附液pH控制在4～6之间。用恒温振荡培养箱以120 r/min于25 ℃振摇12 h，使其达到饱和吸附，抽滤，取吸附液1.0 mL于10 mL比色管中，按1.2.1测量方法操作，测定吸附液中总黄酮的剩余浓度（mg/mL）[8]，按下式计算树脂吸附率：吸附率=[（初始浓度-剩余浓度）/初始浓度]×100%。

滤出经静态饱和吸附后的树脂，用滤纸吸干表面水分，精密加入95%乙醇10 mL，于恒温振荡培养箱以120 r/min在25 ℃振摇12 h，抽滤，取解吸液1.0 mL，按1.2.1测量方法操作，测定解吸液中总黄酮的浓度（mg/mL），按下式计算解吸率：解吸率=[（解吸液浓度×解吸液体积）/[（初始浓度-剩余浓度）×吸附液体积]]×100%。

1.2.5 树脂静态分离纯化参数的优化

1）树脂质量与吸附液体积的比值对吸附率的影响。准确称取筛选好的树脂0.50、0.67、1.00和2.00 g，分别加入20.00 mL 0.771 7 mg/mL的金丝草总黄酮提取液（即吸附液），置于气浴恒温振荡器上不断振摇12 h，并分别测定吸附饱和后提取液的总黄酮浓度，计算吸附率。以树脂质量（g）与吸附液体积（mL）的比值为横坐标、吸附率（%）为纵坐标，绘制曲线[9]。

2）乙醇体积分数对解吸率的影响。选用40%、50%、60%、70%、80%、95%乙醇溶液为解吸剂对吸附饱和的树脂进行解吸，测定解吸液中总黄酮浓度，计算解吸率，绘制曲线[9]。

3）pH对吸附率的影响。用酸度计测得金丝草总黄酮提取液的pH约5.2。分别用HCl和5 g/L NaOH调节至pH 2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00，静置备用。准确称取经预处理的DA-201大孔树脂1.0 g于50 mL锥形瓶中，分别加入不同pH的金丝草总黄酮提取液各10.0 mL，置于气浴恒温振荡器上，以120 r/min于25 ℃振摇12 h，并分别测定吸附饱和后提取液的总黄酮浓度，计算吸附率。以pH为横坐标、吸附率（%）为纵坐标，绘制曲线[9]。

4）作用时间对吸附率的影响。准确称取处理好的DA-201大孔树脂2.0 g于50 mL锥形瓶中，加入20.0 mL金丝草总黄酮提取液，置于气浴恒温振荡器上，以120 r/min于25 ℃振摇，在24 h内每小时吸取1 mL测定总黄酮浓度，绘制静态吸附动力学特征曲线[6]。

1.2.6 树脂动态分离纯化参数的优化

1）吸附流速的确定。将浓度为1.203 5 mg/mL的样品液300 mL通过3根层析柱（一个柱体积为25 mL），分别以1、2和3 mL/min的流速在同一试验条件下进行动态吸附考察，收集流分，取各种溶液1.0 mL，分别测定吸光度，计算吸附率，确定吸附流速[6，8]。

2）吸附液体积的确定。将浓度为1.203 5 mg/mL的样品溶液通过层析柱（一个柱体积为25 mL），按上述所确定的最佳吸附流速进行动态吸附，分段收集吸附液。每5.0 mL为1份，共收集20份。取各种吸附液1.0 mL，分别测定吸光度，计算吸附率，以吸附率（%）为纵坐标，吸附液体积（mL）为横坐标，绘制吸附曲线[6，8]。

3）洗脱流度的确定。将浓度为1.203 5 mg/mL的样品溶液50 mL通过3根层析柱（一个柱体积为25 mL），按上述所确定的吸附条件进行吸附。吸附饱和湿法装柱后用50 mL 70%乙醇分别以1、2和3 mL/min的速度进行洗脱。取各种溶液1.0 mL，分别测定吸光度，计算洗脱液浓度，综合考虑总黄酮解吸率及工作效率，确定最佳洗脱流速[6，8]。

4）洗脱液体积的确定。将浓度为1.203 5 mg/mL的样品溶液通过树脂柱（一个柱体积为25 mL），按上述所确定的吸附条件进行动态吸附，吸附饱和后水洗，至洗涤液为无色为止，湿法装柱，分别用不同体积的70%乙醇，按确定的最佳洗脱流速进行洗脱，分段收集洗脱液。每5.0 mL为1份，共收集20份。取各种洗脱液0.5 mL，分别测定吸光度，计算洗脱液浓度，以洗脱液浓度（mg/mL）为纵坐标，洗脱液体积（mL）为横坐标，绘制洗脱曲线[6，8]，确定洗脱液体积。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的筛选结果

在相同试验条件下进行静态吸附与解吸，其中解吸剂采用95%的乙醇溶液，静态吸附与解吸结果见表1。一般来说，树脂的极性与被吸附分子的极性相同或相近时吸附效果更好；树脂有较大比表面积时吸附量更大，因此筛选树脂时要综合考虑树脂的极性、比表面积等因素。多数黄酮类化合物分子极性不太高，在弱极性或非极性树脂上会有更好的吸附效果[8]。由表1可知，FL-1吸附总黄酮的能力强，但解吸率比较低；FL-3的总黄酮得率处于中等水平。综合考虑各树脂的吸附与解吸性能，DA-201大孔树脂吸附与解吸效果更好，故本试验拟定选用DA-201大孔树脂来分离纯化金丝草总黄酮。

2.2 静态纯化分离参数的优化结果

2.2.1 树脂质量与吸附液体积的比值对吸附率的影响 对于一定量的吸附质而言，吸附剂用量增大，意味着吸附比表面积增大，吸附质在吸附剂上的分布较松散，从而吸附剂对吸附质的物理作用和化学作用加强，吸附量增加。但从经济角度讲，吸附剂用量过多，会导致成本增加、吸附选择性差等[9]。由图1A可知，树脂质量与吸附液体积的比值为1∶10时，即可达到较好的吸附效果。

2.2.2 乙醇体积分数对解吸率的影响 由图1B可知，解吸率随乙醇体积分数的增大而增加，尤其是在乙醇体积分数为40%～70%时，解吸率从59.68%增加到98.37%，但乙醇体积分数为70%～95%时，解吸率增幅缓慢。综合考虑解吸率和生产成本，选择70%为最佳的乙醇体积分数。

2.2.3 pH对吸附率的影响 由图1C可知，吸附液的pH对树脂的吸附有较大的影响，在pH 3.00时，树脂的吸附率达到最大。总黄酮显酸性，在酸性条件下呈分子状态，以氢键方式被吸附，因而树脂吸附率大，但若酸性过强，总黄酮易生成烊盐，使吸附效果变差[10]。本试验以pH 3.00的吸附液上柱。

2.2.4 作用时间对吸附率的影响 由图1D可知，大孔树脂对金丝草总黄酮的吸附为快速平衡型。在3 h后就几乎不再吸附，吸附率为76.18%。8 h时吸附率为76.90%，增幅很小；最终24 h时的吸附率为78.48%，与3 h时的相差不大。因此，DA-201大孔树脂对金丝草总黄酮具有良好的吸附动力学特性，吸附速度快，符合工业化生产的需要。

2.3 动态纯化分离参数的优化结果

吸附流速主要是影响溶质在树脂表面的扩散。如果流速太高，溶质分子来不及扩散到树脂的表面，树脂不能充分吸附溶质。随着吸附流速的加快，总黄酮的吸附量越来越少。综合考虑总黄酮吸附率及工作效率，最终确定最佳的吸附流速为2 mL/min（图2A）。由图2B可知，当上柱的吸附液体积为1/5个柱体积即5 mL时吸附趋于平衡，树脂不再吸附。洗脱液的洗脱流速过快或者过慢都不好，洗脱流速过快，洗脱液还未来得及吸附总黄酮，就已流出层析柱；因而洗脱流速慢有利于对总黄酮的吸附，但是洗脱流速过慢耗时，在生产上很不经济，特别是大工业生产时大大增加了生产成本。因此洗脱流速应首先保证大部分的总黄酮能基本被洗脱下来，洗脱流速越快越好[11]。由图2C可知，最佳洗脱流速为2 mL/min。由图2D可知，当洗脱液体积为15 mL时，洗脱液中总黄酮浓度最高，当体积为75 mL时，几乎洗脱完全。考虑到洗脱液用量过多会增加洗脱时间，造成浪费，故确定以3个柱体积为最佳的洗脱液体积。

3 结论

根据5种大孔树脂静态吸附和解吸动力学特性所显示的树脂性能，DA-201大孔树脂的综合性能较佳，有较高的吸附率和解吸率，适合于金丝草总黄酮的吸附纯化。

DA-201大孔树脂对金丝草总黄酮的静态吸附与解吸优化条件：吸附液pH 3.00，树脂质量与吸附液体积的比值为1∶10，洗脱液乙醇的体积分数为70%，恒温振荡时间3 h。

DA-201大孔树脂动态纯化分离金丝草总黄酮的工艺参数为：吸附液为1.203 5 mg/mL，吸附流速为2 mL/min，当吸附液体积为1/5个柱体积时吸附趋于平衡，树脂不再吸附。洗脱剂用量为3个柱体积，洗脱速度为2 mL/min，应用DA-201大孔树脂纯化总黄酮得到了满意的效果。

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