铜绿假单胞菌耐药机制研究现状

摘要：铜绿假单胞菌为条件致病菌，是目前院内感染重要病原菌之一，且由于自身结构及抗菌药物诱导等作用，该菌极易发生耐药，成为临床上常见耐药菌之一。铜绿假单胞菌的耐药机制目前主要归结于以下六种：①细菌产生抗生素水解酶或钝化酶，如β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等，使抗菌药物失活。②细菌改变抗菌药物作用的靶位。③外膜通透性降低，使药物不易进入菌体，故对多种不同结构的抗菌药物高度耐药。④生物膜形成，营养限制、渗透障碍和免疫逃逸三种学说解释了生物膜导致耐药的原因。⑤主动泵出系统，使药物直接泵出到菌体外。⑥耐药基因的存在。本文将就以上几种耐药机制进行综述。

关键词：铜绿假单胞菌；感染；耐药；机制；基因

Abstract：As opportunistic pathogen， Pseudomonas aeruginosa has become a major pathogen for nosocomial infection. Because of its structure and the role of antimicrobial agents， the bacteria can easily become resistant and become one of the most common drug resistant strains in clinic. It’s mechanism of drug resistance is as follows：①bacteria produce antibacterial activity. ②Change the target of antibiotics. ③the permeability of the membrane is reduced.④Biofilm formation.⑤Active pumping system.6. the existence of drug resistance gene. we will review the mechanism of drug resistance below.

Key words：Pseudomonas aeruginosa；Infection；Drug resistance；Mechanism；Gene

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）原称绿脓杆菌，在自然界分布广泛，对人类而言，属于条件致病菌，长期应用激素、因使用免疫抑制剂或进行肿瘤放化疗导致免疫功能低下，某些有创操作 （如气管切开），留置体内导管（如导尿管、深静脉置管等）或手术后的病人易感染本菌，故该菌是医院内感染的重要病原菌之一。自身结构的改变及抗菌药物诱导等原因使其极易产生耐药，从而成为临床上主要的耐药菌之一，且其耐药率呈上升趋势，给临床治疗造成极大困难。本文将就PA耐药机制作一综述。

1 铜绿假单胞菌细菌学特点

铜绿假单胞菌是土壤中最常见的细菌之一，主要生存在潮湿环境中，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。菌体细长，形态呈球杆状或线状，成对或短链状排列。菌体一端有单鞭毛，无芽胞，在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可看见细菌运动活跃。该菌含有O抗原（菌体抗原）以及H抗原（鞭毛抗原）。O抗原包含两种成分：①是外膜蛋白，为保护性抗原；②是脂多糖，具有特异性。

2 铜绿假单胞菌感染现状

我国临床分离的PA对常用抗菌药物的耐药性处于比较高的水平，这在2010年CHINET铜绿假单胞菌耐药性监测中已明确提示，且多药耐药的PA逐年升高，给临床治疗带来了极大的困难。我国美罗培南监测研究（Chinese Meropenem Surveillance Study，CMSS）结果显示在2003年、2004年、2006年及2008年间分离出的铜绿假单胞菌MDR株约占该菌检出总株数的比例分别为11.3%、14.9%、13.3%及17.1%[1]。ICU是我们重点监控的科室，这是由于ICU患者基础疾病多而重，常需应用广谱抗菌素甚至联合用药，并且体内置管及机械通气的应用，使感染耐药菌的机会大大增加[2]，2010年度卫生部对ICU来源细菌耐药性监测结果显示PA对亚胺培南和美罗培南的耐药率分别达到了40.4%和34.9%[3]，耐药现状令人堪忧。

3 铜绿假单胞菌耐药机制

感染铜绿假单胞菌患者治疗效果不理想的重要原因就是铜绿假单胞菌产生耐药性，其耐药机制异常复杂，总括之，主要与以下因素有关。

3.1细菌可以产生抗生素水解酶或钝化酶使之失活，如β-内酰胺酶、氨基糖苷钝化酶等。PA产生的β-内酰胺酶主要包括头孢菌素酶（AmpC）、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）及金属酶（MBL）。β-内酰胺酶通过水解β-内酰胺环，使抗菌药物失活。β-内酰胺酶的产生可以是染色体依赖的，也可以是质粒介导的，即获得性耐药。获得性耐药作为耐药菌流行的主要方式，应该引起人们足够的重视。氨基糖苷类药物通过不可逆结合到细菌30S核糖体亚单位抑制细菌蛋白质的合成，产生杀菌作用，而细菌可通过质粒编码氨基糖苷类修饰酶，作用于特定的氨基或羟基，减少了氨基糖苷类抗菌药物与核糖体的结合，使氨基糖苷类药物发生钝化获得耐药[4-5]。金属酶是一种钝化酶，也是由细菌产生的，对几乎所有的β-内酰胺类抗生素均具有水解活性，是目前所知最强的β-内酰胺酶，但部分研究认为产金属酶并不是广泛耐药铜绿假单胞菌（ extensively drug resistant Pseudomonas aeruginosa，XDRPA）耐药的主要机制[6-7]。

3.2细菌可以改变抗菌药物作用的靶位而使其失去作用位点：抗生素作用靶位在微生物生长与存活中起重要作用。很多抗生素就是通过作用于这些作用靶位干扰细菌的生长来发挥抗菌活性的。青霉素结合蛋白（PBP）位于细菌内膜，是β-内酰胺类抗菌药物的作用靶位。喹诺酮类抗菌药物的作用靶位是细菌DNA拓扑异构酶Ⅱ和拓扑异构酶Ⅳ。氨基糖苷类抗菌药物的作用靶位是16s核糖体RNA（16srRNA）。而青霉素结合蛋白、DNA拓扑异构酶等结构发生改变，即作用靶位改变，就可使细菌逃避抗菌药物的抗菌作用，从而产生耐药性[8-9]。

3.3细胞膜的通透性降低使抗生素无法进入细胞以致不能到达作用靶位发挥作用：抗菌药物要进入细胞内就必须穿过细菌的细胞外膜，到达作用靶位才能发挥其抗菌作用。PA的外膜由微孔蛋白孔道组成，只有小分子量糖类可以通过这些微孔蛋白扩散，LPS分子通过特定脂肪酸链相互铰链，可以使得膜流动性和通透性降低，从而阻碍了脂溶性药物通过细菌外膜[10]，另外膜通透性由于脂多糖结构改变或外膜蛋白编码基因发生突变而降低或消失，药物不易进入菌体，产生高度耐药。

3.4生物膜形成 菌体和自身分泌的胞外基质组成了我们所说的生物被膜（BF），其中，藻酸盐是PA生物被膜中胞外基质的主要成分。生物被膜的形成可加速细菌耐药性的传播，增加了临床诊疗难度，严重威胁人类健康。其耐药机制目前尚不十分清楚，营养限制、免疫逃逸和渗透障碍是人们比较认可的三种学说。营养限制学说主要是指生物膜内菌体细胞由于缺乏氧及营养物质导致代谢率下降，而处于这种饥饿状态的细菌对抗生素是不敏感的；免疫逃逸学说则认为机体对细菌的免疫力受生物被膜存在所阻碍，机体免疫力减弱，抗菌的协同杀菌作用下降[10]，同时，藻酸盐可以直接抑制中性粒细胞、巨噬细胞趋化、吞噬作用，从而引起免疫逃逸；渗透障碍学说认为BF中细菌密度高，菌株之间空间狭小，且被大量的胞外基质所填充，组成一道屏障阻碍抗生素穿透生物被膜，这样抗菌药物就难以对包裹在菌膜内的细菌发挥作用。

3.5通过主动外排机制将进入胞内的药物泵至胞外 PA的主动外排系统是开口于外膜的复合体，主要由外膜通道蛋白、内膜蛋白及连接蛋白或辅助蛋白3部分组成，其可主动将药物直接泵出到菌体外[11]。根据PA全基因组序列分析，推测该菌至少有12种主动外排系统，至今已经通过基因检测发现了7种[12]。外排泵MexAB-OprM的高表达在PA对碳青霉烯类耐药中可能起到重要作用[13-14]。

3.6耐药基因 PA耐药基因的水平传播日趋严重，在PA的耐药菌中，整合子常携带一个或多个耐药基因，细菌可通过携带耐药基因的整合子获得外源性耐药基因从而造成菌间传播。整合子的概念是1989 年Stokes 和Hall 提出的[15]，整合子常位于质粒、转座子上，可捕获和整合细菌耐药基因。整合子可以随质粒、转座子在细菌种内和种间广泛传播，在细菌多重耐药机制中起重要作用[16-17]。有研究证实铜绿假单胞菌中有 I 类整合子的分布，I 类整合子阳性菌株及转移接合子较阴性菌株更易产生耐药[18]。陈华彬等人用PCR法检测了49种PA相关耐药基因及外膜通道蛋白oprD2基因，并作了R型聚类分析，最后得出结论，49株多药耐药PA对头孢菌素耐药主要与A类（有PER、TEM、SHV、CTX-M-13型等基因）和D类（有OXA-10、OXA-14、OXA-17、OXA-2、OXA-23、OXA-51等基因）β-内酰胺酶基因有关[19]。外膜蛋白基因的缺失或表达下调则是PA对碳青霉烯类耐药的主要机制之一，研究显示PA外膜蛋白缺失率达到38.89%-97%[7，20-23]。汪宏良等研究证明PA氨基糖苷类抗菌药物耐药主要与16S rRNA 甲基化酶编码基因rmtB 及5 种氨基糖苷类修饰基因有关， 并发现了两种铜绿假单胞菌16S rRNA 甲基化酶编码基因rmtB 新亚型[24]。氨基糖苷类抗生素（AmAn） 修饰酶基因有aac（3′）-Ⅱ、aac （6′） -Ⅰb、aac （6′）-Ⅱ、ant （2′′）-Ⅰ、ant （3′′） -Ⅰ、aac（3′）-Ⅰ、aph（3′）-VIa及aph（3′）-IIb等。Aghazadeh 等报道aph（3′）-VIa （90.6%） 及aph（3′）-IIb （61.8%）的检出率较高[25]，国内有研究发现多重耐药PA氨基糖苷类修饰酶基因以aac（6′）-II检出率最高[26]，而乌洪芳等从糖尿病足中分离出的PA对氨基糖苷类抗生素的耐药基因检出率最高的为ant（3′′）-I（65.85%）[27]。明德松等对PA喹诺酮类药物的耐药机制进行了Meta分析，认为我国PA耐喹诺酮类药物的机制是以gyrA基因突变为主的[28]。

PA 有其天然的耐药性， 但临床上导致其耐药的重要因素是抗生素的不合理应用，抗菌药物的分级管理有待进一步加强，而动态监测临床分离的PA耐药性，依据药敏结果合理规范选用抗菌药物，可以有效延缓和控制细菌耐药的发生并防止耐药菌株的播散。而破解PA的耐药机制、充分发挥抗生素的抗菌活性将是我们更高一步的奋斗目标。

参考文献：

[1]Wang H， Chen M， Ni Y， et al. Antimicrobial resistance among clinical isolates from the Chinese Meropenem Surveillance Study （CMSS）， 2003C2008[J]. Int J Antimicrob Agents， 2010， 35（3）： 227-234.

[2]陈越，孙景勇，倪语星，等.2012年中国CHINET铜绿假单胞菌耐药性监测[J].中国感染与化疗杂志，2015，15（3）：199-203.

[3]张丽，杨文航，肖盟，等.2010年度卫生部全国细菌耐药监测网报告：ICU来源细菌耐药性监测[J]. 中华医院感染学杂志， 2012， 22（1）：34-38

[4]Morata L，Clbos-Trigueros N，Martinez JA，et al.Influence of multidrug resistance and appropriate empirical therapy on the 30-day mortality rate of Pseudomonas aeruginosa bacteremia[J].Antimicrob Agents Chemother，2012，56（9）：4833-4837.