不同补肾法诱导的骨髓间充质干细胞对脑梗死大鼠神经功能恢复的促进作用

摘要：目的 探讨不同补肾法诱导的骨髓间充质干细胞（BMSCs）对脑梗死大鼠神经功能恢复的影响。方法 用线栓法制备大鼠大脑中动脉梗死（MCAO）模型，随机分为假手术组、模型组、单纯BMSCs移植组及左归丸、右归丸、地黄饮子、维甲酸诱导BMSCs移植组。移植后3、7、14 d进行大鼠神经功能综合测评，于移植后7、14 d处死大鼠，采用TTC染色法测定脑梗死面积，并采用免疫组化方法检测脑组织神经突触素（syn）的表达。结果 与模型组比较，各移植组7、14 d的神经功能评分均显著增高（P

关键词：补肾法；骨髓间充质干细胞；脑梗死；神经功能；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.03.015

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）03-0036-04

目前，治疗脑梗死的方法主要有内科药物、外科手术及血管内治疗等，但均不能获得满意的疗效。因此，考虑通过干细胞移植的方法重建神经通路，恢复或改善神经功能障碍成为近年来医学领域备受关注的研究热点。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞，不但取材容易，还具有很好的增殖能力，并且具有向脂肪、成骨、软骨、肌肉、神经等各胚层组织细胞分化的能力。本实验采用线栓法制备大鼠大脑中动脉梗死（MCAO）模型，不同补肾法诱导BMSCs移植治疗脑梗死，探讨其促进脑梗死后神经功能恢复的作用，为中西医结合治疗脑梗死提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

提取BMSCs的动物：SPF级Wistar大鼠15只，雌雄不限，体质量（120±10）g；制备含药血清动物：SPF级Wistar大鼠40只，雌雄不限，体质量（250±20）g；造模动物：SPF级Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量（300±30）g。以上动物皆由甘肃中医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（甘）2004- 0006。

1.2 药物、试剂与仪器

L-DMEM培养基（Gibco Invitrogen Corporation，批号1240031），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号090123），0.25%胰酶（Sigma），L-谷氨酰胺（上海新兴医药保健品科技开发中心，批号991085），全反式维甲酸RA（Sigma），CD45荧光标记抗体（Gibco），CD90荧光标记抗体（Gibco），2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，WOLSEN公司，批号0765），小鼠抗大鼠神经突触素（syn）单克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司，批号200906）。二氧化碳培养箱（SANYO Electric Co.Ltd，型号MOA-18ALC），超净工作台（苏州净化仪器厂，型号SW-CJ-2FD），流式细胞仪（美国贝克曼公司）。

2 实验方法

2.1 骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定

采用全骨髓贴壁筛选法分离培养、纯化BMSCs，经流式细胞仪检测BMSCs表面标志CD90及造血干细胞表面标志CD45的表达率。

2.2 中药药物血清制备

40只Wistar大鼠，随机分为空白组、左归丸组（补益肾阴法代表方药）、地黄饮子组（阴阳双补法代表方药）和右归丸组（补益肾阳法代表方药）。晚禁食，第2日，空白组给予生理盐水，其余组给予药液（剂量按1 g/100 g大鼠体质量），2次/d，连续3 d。于第3日给药后2 h从股动脉取血，3 000 r/min离心10 min，分离血清，56 ℃灭活30 min，0.22 ?m滤器过滤除菌，分装，-20 ℃保存备用。

2.3 药物血清孵育

将已纯化的BMSCs（F3代）接种至培养瓶中，待细胞70%～80%融合后，弃完全培养液，随机分组，分别用含10%左归丸、右归丸、地黄饮子药物血清和维甲酸的L-DMEM培养液孵育，连续培养3 d。将诱导的BMSCs用0.25%胰酶消化，待细胞变形、间隙增大，加入含10%胎牛血清的L-DMEM中止消化，磷酸盐缓冲液轻洗，吹打成1×106个/mL细胞悬液，备用。

2.4 造模

健康Wistar大鼠60只参照文献[1]方法建立Wistar大鼠MCAO模型。10%水合氯醛腹腔麻醉（0.3 mL/100 g）后，将大鼠于颈部正中切开皮肤，结扎颈外动脉远端后，于其近端插入直径0.25 mm尼龙线，将尼龙线缓慢向颅内推进，进线约18 mm左右，略感阻力，即到大脑中动脉起始部，阻断右侧大脑中动脉2 h后，将尼龙线拔至颈外动脉残端，剪断尼龙线，缝合皮肤切口。另选8只大鼠作为假手术组对照，仅分离左侧血管和神经，结扎颈外动脉远端，不插入尼龙线，即缝合皮肤切口。MCAO后24 h进行大鼠神经功能评分，参考Longa及Bederson[2]评定神经功能缺损程度的5级4分法标准进行评分。0分：无神经系统症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：爬行时转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自行行走，意识丧失。评分为1～3分者提示模型成功，可按预定方案给予相应的干预措施。

2.5 药物血清孵育骨髓间充质干细胞的移植

实验大鼠随机分为假手术组、模型组、单纯BMSCs移植组及左归丸、右归丸、地黄饮子、维甲酸诱导BMSCs移植组，各组大鼠于造模24 h后，取F3代经不同补肾类中药和维甲酸孵育的各组BMSCs，用胰酶消化，加入含10%胎牛血清L-DMEM中止消化，用等渗PBS液吹打成细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，弃上清液，再加入等渗PBS液，吹打成细胞悬液，让细胞充分、均匀悬浮于培养液中，进行细胞计数，将细胞浓度调至约2×106个/L。再取细胞悬液约1 mL于模型大鼠尾静脉注射。

2.6 移植后大鼠神经功能综合测评

神经功能测评方法按文献[3-5]从自发运动、轻瘫实验、角膜反射、耳道反射、痛觉、霍纳征6个方面进行，总分为18分，症状越重，得分越少。神经功能测评时间在术后3、7、14 d进行。测评标准：①自发活动：3分，四周活动，探索环境，至少到达三面墙壁；2分，活动少、迟疑、缓慢，但最终至少探索一面墙壁；1分，饲养筐内缓慢活动，不探索筐壁。②四肢对称运动（轻瘫实验）：3分，四肢对称伸展；2分，右侧肢体伸展较左侧差；1分，右侧肢体活动明显减少。③角膜反射：3分，灵敏，左右对称；2分，右侧较左侧差；1分，右侧反射缺如。④耳道反射：3分，左右对称，灵敏；2分，右侧较左侧差；1分，右侧反射缺如。⑤痛觉：3分，针刺疼痛刺激反应两侧对称灵敏；2分，右侧疼痛刺激反应较左侧差；1分，右侧疼痛刺激无反应。⑥霍纳征：3分，双眼睑等大，对称；2分，右眼睑缩小；1分，右眼睑闭合，眼球内陷。

2.7 2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色法测定脑梗死面积

于移植后7、14 d处死大鼠，断头取脑，去除嗅球、小脑和脑干，立即将脑组织置-20 ℃冰箱20 min，取冠状面均匀切成1 mm厚脑片5～6片，将第三切片迅速置于2%TTC溶液（37 ℃）中染色30 min左右，观察染色效果。数码相机拍照。正常脑组织为红色，梗死区域脑组织为白色，用AutoCAD软件计算和测定脑组织梗死面积和总脑片面积，以脑梗死面积占总脑片面积百分数（%）表示。

2.8 脑组织神经突触素表达水平的检测

于移植后7、14 d用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，手术充分暴露心脏，以9号注射针头通过左心室心尖部穿刺插管至主动脉弓，切开右心耳。先以0.9%氯化钠溶液大约120 mL快速灌流，待右心耳流出无色透明液体，再以4%多聚甲醛灌注固定，直至肝脏退色变硬，四肢、尾变硬，开颅取出全脑，用4 ℃生理盐水冲洗3次，除去积血，用滤纸吸去表面水分，去除嗅球、小脑和脑干。于冰盘上快速分离右侧大脑半球，弃去左侧大脑半球，以前囟为中心前后1 mm（病变损害的中心）冠状切取大鼠脑组织，置于4%多聚甲醛固定液中，切取厚约2 mm的脑组织，常规石蜡包埋，用免疫组化法进行测定。syn阳性反应呈棕黄色，呈细索状或小圆形分布。每组观察6张切片，合计30个视野，计数阳性细胞，计算平均值。

3 统计学方法

应用SPSS16.0统计软件进行统计分析，数据用―x±s表示，采用方差分析，P

4 结果

4.1 大鼠骨髓间充质干细胞的形态及CD90、CD45表达

F3代细胞形态单一均匀，融合后呈典型的极性，漩涡状生长（见图1）。经流式细胞仪检测BMSCs表面标志CD90及造血干细胞表面标志CD45的表达，CD90+和CD45-细胞为97.0%（见图2）。

4.2 不同补肾法对大鼠神经功能评分的影响

模型组大鼠3、7、14 d的神经功能评分均较假手术组显著降低（P0.05），7、14 d的神经功能评分均显著增高（P

4.3 不同补肾法对大鼠脑梗死面积的影响

模型组大鼠7、14 d的脑梗死面积均较假手术组增大（P

4.4 不同补肾法对大鼠脑组织神经突触素表达的影响

假手术组syn发生阳性表达，模型组7、14 d的大鼠syn阳性细胞数均较假手术组降低（P

5 讨论

脑梗死会引起脑组织缺血、缺氧，甚至软化坏死，梗死中心区神经细胞严重受损，从而导致神经功能障碍。研究表明， BMSCs移植可以治疗脑梗死，其效应多体现在脑缺血后神经功能的改善以及与之相关的梗死体积的变化。大鼠短暂性MCAO后静脉注射异体BMSCs可改善神经功能，雌性大鼠脑缺血24 h后静脉给予雄性大鼠的BMSCs，部分神经功能恢复[6]。张氏等[7]也认为移植入脑的BMSCs能促进脑梗死大鼠的神经功能恢复，但是没有发现移植后梗死灶体积缩小。

本研究结果表明，补益肾阴法（左归丸）、阴阳双补法（地黄饮子）、补益肾阳法（右归丸）方药孵育BMSCs移植可以促进脑梗死大鼠神经功能的恢复，缩小脑梗死面积，其机制可能是不同补肾法方药诱导BMSCs移植治疗脑梗死对突触重塑具有促进作用，从而改善脑梗死大鼠的神经功能。并且补益肾阴法、阴阳双补法方药作用优于补益肾阳法方药，这符合中医“肾生髓，通于脑”理论实质。骨、髓、脑三者皆来源于先天的肾之精气。BMSCs来源于骨髓，而骨髓又属阴髓，故补益肾阴法、阴阳双补法可促进BMSCs的增殖，并且有利于BMSCs在脑内的存活及分化，从而达到对脑缺血损伤后神经的保护和修复作用。

参考文献：

[1] Yuji K， Kazuo M， Takenori Y， et al. Nylonmomofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rat[J]. Stroke， 1995，26：1655-1657.

[2] Bederson JB， Pitts LH， Tsuji M， et al. Rat middle cerebral artery occlusion evaluation of the model and development of a neurologic evaluation[J]. Stroke，1986，17（3）：472-476.

[3] 宋书欣，邓志锋，汪映，等.骨髓间充质干细胞移植治疗脑缺血大鼠的实验研究[J].中国微侵袭神经外科杂志，2005，10（2）：77-79.

[4] Artandi SE， Depinho RA. Telomeres and telomerase in cancer[J].

Carcinogenesis，2010，31：9-18.

[5] Dominici M， Le Blanc K， Mueller I， et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement[J]. Cytotherapy， 2006，8（4）：315-317.

[6] Chen J， Li Y， Katakowski M， et al. Intravenous bone marrow stromal cell therapy reduces apoptosis and promotes endogenous cell proliferation after stroke in female rat[J]. Neurosci Res，

2003，73（6）：778-786.

[7] 张苏明，褚倩.成体干细胞移植治疗大鼠脑缺血[J].中华医学杂志， 2004，84（16）：1328-1330.

（收稿日期：2012-08-29，编辑：华强）