TGF-β1影响人牙周膜成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶-1的初步研究

[摘要]目的:研究转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)在体外对人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,HPDLFs)分泌基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)的影响,进而探讨TGF-β1对HPDLFs分泌MMP-1的调控作用,以期为通过生物学途径建立防治正畸过程中牙根吸收的有效方法提供理论依据。方法:原代培养HPDLFs,取传代至第5代HPDLFs实验。设立TGF-β1工作浓度梯度:0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.07ng/ml、0.09ng/ml;0ng/ml TGF-β1为空白对照组;选取4h、8h、12h、24h、48h 5个时间点收获上清液。双抗体夹心酶联免疫吸附实验 (enzyme-linked-immunosorbent serologic assay,ELISA)法检测各样本中MMP-1含量。采用多元线性回归方法分析实验结果。结果:MMP-1分泌量与TGF-β1作用时间总体上存在时间依赖性,具有统计学差异,P

[关键词]牙根吸收;转化生长因子β1;基质金属蛋白酶-1;牙周膜成纤维细胞

[中图分类号]R783 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455(2010)02-0245-05

The preliminary study of TGF-β1 effect onhuman periodontal ligament fibroblasts secreting MMP-1

LIU Qi1,CAO Jun1,LI Zhi-dong2,XIE Han3,LIU Xin-wei1,XU Jing4,LI Xin-ping5

(1. Department of Orthodontics, School of Stomatology of Fourth Military Medical University, Xi’an 710032,Shaanxi,China;2. Department of Microorganism of Fourth Military Medical University;3. Department of Periodontics, School of Stomatology of Tongji University;4. stomatological hospital of Xi’an Second Hospital;5. Department of Stomatology affiliated to Naval Command College)

Abstract:Objective To investigate the biological effects of transforming growth factor-β1(TGF-β1) on human periodontal ligament fibroblasts(HPDLFs) secreting matrix metalloproteinase-1(MMP-1). Methods HPDLFs were exposed to TGF-β1 at various concentrations(0.03ng/ml,0.05ng/ml,0.07ng/ml and 0.09ng/ml) in monolayer cultures.The levels of MMP-1 secreted by the TGF-β1-treated HPDLFs were measured using an enzyme-linked immunosorbent assay.Differences between experimental and contol groups were tested using multiple linear regression analysis.ResultsOur data demonstrate TGF-β1 treatment significantly increased the secretion of MMP-1 in a time-dependent manner(P

Key words:root resorption;TGF-β1;MMP-1;HPDLFs

牙根吸收是正畸治疗过程中的常见并发症。有学者认为几乎所有的正畸患者都存在某种程度的牙根吸收[1-2]。虽然大部分牙根吸收没有明显的临床症状,但严重者则可能危害牙齿与牙周组织健康,因此正畸医师必须对根吸收有足够的认识。大部分关于牙根吸收与正畸治疗关系的研究表明, 基质金属蛋白酶在牙周组织改建过程中起着至关重要的作用,其中属于胶原酶类的MMP-1参与了细胞外I、II、III、VII,X 型胶原纤维的降解,其表达分泌与牙周组织改建、牙根吸收的发生密切相关。本研究旨在通过检测TGF-β1对人牙周膜成纤维细胞分泌MMP-1的调控,进而筛选出与正畸过程中牙根吸收发生发展相关的生物因子,以备进一步建立牙根吸收的防治策略。

1材料和方法

1.1 实验材料:①细胞培养用10%胎牛血清αMEM培养液含双抗(100 U/ml青霉素,100 mg/ml链霉素)、无血清αMEM培养液含双抗(100U/ml青霉素,100mg/ml链霉素)、胰酶、胶原酶、磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline,PBS)均由第四军医大学口腔医学院组织工程实验中心提供;②TGF-β1购自美国Peprotech公司,北京中杉金桥生物技术有限公司代购,纯度>98%;③人基质金属蛋白酶-1(MMP-1)酶联检测试剂盒(ELISA Kit)购自北京中杉金桥生物技术有限公司(预包被)。

1.2 实验方法:

1.2.1细胞培养:原代培养HPDLFs,取14岁男性青少年因正畸治疗需要拔除的双侧下颌第一前磨牙。拔牙术前拍摄根尖X线片并进行详尽的牙周检查,确定该患者双侧下颌第一前磨牙发育完好,牙周组织健康。术后用PBS反复冲洗牙齿,刮取根中1/3处的牙周膜组织,眼科剪剪碎,至0.5～1mm大小,后用10%胎牛血清αMEM培养液冲洗已剥离组织3次;为使HPDLFs顺利从组织块中爬出,使用胶原酶消化20min,4×镜下观察见组织块形态松散,终止消化,离心移去上清;提取组织,置于6孔板中,玻片加压,加入适量10%胎牛血清αMEM培养液,后移至37℃、5%CO2孵箱培养。每隔24h镜下观察细胞生长情况。当细胞自组织块边缘游出,成片生长至6孔板底面积80%时,进行传代培养,每48h给细胞换液,取第5代细胞进行实验。

1.2.2各实验组及对照组细胞上清样本收集:根据所购生物因子TGF-β1说明书指示,设立TGF-β1工作浓度梯度:0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.07ng/ml、0.09ng/ml,即为4个实验组;采用0ng/ml TGF-β1为对照组。取传代至第5代HPDLFs,消化重悬,接种于小方瓶中。将加有上述各浓度TGF-β1 10%胎牛血清αMEM培养液分别加至小方瓶,每瓶4ml,放入37℃、5%CO2孵箱培养。分别于细胞培养至4h、8h、12h、24h、48h各时间点收获上清液,每组取200μl,后立即置入-20℃低温冰箱冻存。

1.2.3双抗体夹心ABC-ELISA法检测MMP-1含量:通过双抗体夹心ABC-ELISA法检测各样本上清中MMP-1含量。根据试剂盒说明书指示:抗人MMP-1单抗已包被于酶标板上(48孔 预包被);将ELISA检测试剂盒中的标准品分别加入酶标板第1、2列;第2列为复本,以求减小误差;通过倍比稀释标准品建立标准曲线 (孔H1、H2为空白对照)。

将各实验组、对照组样本上清液按布孔设计依次添加至酶标板各孔,37℃孵育120min,洗板,滤干;加入一抗工作液,每孔50μl,37℃孵育60min,洗板,滤干;加入酶标抗体工作液,每孔100μl,37℃孵育60min,洗板,滤干;每孔加入底物工作液100μl,置37℃暗处反应7min;肉眼观察酶标板已有显色反应,每孔加入50μl终止夜终止反应;在492nm处测吸光值。以上各步骤均严格遵照检测试剂盒说明书操作。

1.2.4数据处理:使用SPSS12.0统计软件包,将所测得MMP-1含量用多元线性回归方法进行统计分析。

2结果

2.1 HPDLFs原代培养情况:原代培养细胞从组织块中爬出时间为10～14天。镜下观察见:细胞以组织块为中心,呈放射状排列生长,局部形成生长晕,细胞呈长梭形或多突起星形,胞突细长,胞体丰满,胞质均匀,核圆形或卵圆形,核仁清晰。由细胞形态和组织来源鉴定该细胞确为人牙周膜成纤维细胞。传代后细胞生长旺盛,状态良好,性状稳定。

2.2 各实验浓度TGF-β1对HPDLFs分泌MMP-1的影响:结果R2值为0.999,说明此次ELISA检验方法严格遵循操作步骤,结果真实可靠。选取由已建立标准曲线所得方程y= 0.197x2 + 0.775x-0.046。R2=0.999 作为标准方程,用Excel换算出酶标板各孔。

经由多元线性回归分析得出,以0.05为检验水准,MMP-1分泌量与所设立TGF-β1作用时间梯度存在线性正相关关系。 线性方程:y=0.003+0.002x P=0.033

3讨论

正畸治疗中牙齿移动是一个复杂的生物学过程,是不同组织、细胞和生物因子共同作用的结果[2-3]。HPDLFs是牙周膜中数量最多,功能最重要的细胞,参与牙周组织改建、再生。多种生长因子可通过不同的生物学机制调节HPDLFs的活性,进而影响牙周组织改建。

MMPs是一族锌离子依赖性内肽酶,其主要功能在于降解细胞外基质(Extra Cellular Matrix,ECM)中的胶原、纤维连结蛋白等物质[3-4]。ECM的正常生理代谢依赖于MMPs及其组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)二者之间的动态平衡[5]。研究表明,胶原酶(MMP-1)和明胶酶(MMP-2、MMP-9)都是牙根吸收,牙周组织改建过程中的关键酶[6]。MMP-1由成纤维细胞、巨噬细胞、上皮细胞等多种细胞分泌,主要作用底物为I、II、III、VII、X型胶原,明胶,蛋白多糖等[4];在正畸治疗牙齿移动过程中对ECM的合成、降解起重要调控作用。此过程中,首先由破牙骨质细胞分泌酸,使牙骨质脱矿,继而通过分泌各种酶将残留的有机物分解。牙周组织主要纤维成分中I型胶原纤维所占比例最多,少部分为III型[7],这两种胶原恰是MMP-1作用的底物;已建立的机械力所致牙根吸收的动物模型显示MMPs的合成及分泌有所增加,其龈沟液中MMP-1、MMP-2及MMP-8的水平均高于正常[8];提示MMP-1对牙周组织的代谢有直接调控作用。此外MMP-1还是MMP-2等其他MMPs的启动因子,它的活化可启动一系列酶活性反应[4],进而参与牙根吸收。

TGF-β1属肝素生长因子家族,是一种具有多项调节功能的生物因子,在体内可同时调节多种相关蛋白的表达与分泌,影响多种细胞的生长、分化及功能[9]。研究表明,牙周膜发育过程中,TGF-β1及其受体在HPDLFs、成骨细胞和成牙骨质细胞内均有较强表达,提示TGF-β1参与牙周组织发育、改建等一系列过程,对ECM的合成和降解有重要调控作用[9]。

那么TGF-β1是通过什么途径达到调控ECM代谢,进而影响牙周组织改建,参与牙根吸收的呢?MMP-1作为牙根吸收过程中最为重要的酶之一,其表达与分泌与牙根吸收的发生发展直接相关,它与TGF-β1有着什么样的关系,MMP-1的分泌是否受到TGF-β1的调控呢?

本实验通过设立TGF-β1对HPDLFs作用的浓度梯度和时间梯度,采用双抗体夹心ELISA的方法检测HPDLFs上清中MMP-1的分泌量,以验证HPDLFs分泌MMP-1与TGF-β1的作用是否同时存在剂量依赖性和时间依赖性。结果表明,MMP-1分泌量与TGF-β1的作用时间总体上存在时间依赖性,具有统计学差异。P=0.033

综上所述,HPDLFs分泌MMP-1与TGF-β1作用时间总体上存在时间依赖性,但在不同作用时间下HPDLFs分泌MMP-1对不同TGF-β1工作浓度并没有表现出一致的剂量依赖关系。由于本研究样本量较小,对于TGF-β1影响HPDLFs分泌MMP-1只能作一个初步的探寻性研究,更深入的探讨需要在扩大样本量后再继续进行。

[参考文献]

[1]麦理想,谢永建.基质金属蛋白酶及其抑制剂与牙根吸收的研究进展[J].国际口腔医学杂志,2007,34(3):188-191.

[2]庄 丽,白玉兴.基质金属蛋白酶在正畸源性牙根吸收中的作用[J].北京口腔医学,2007,15(5):295-297.

[3]Murray C.Meikle The tissue,cellular,and molecular regulation of orthodontic tooth movement: 100 years after Carl Sandstedt [J]. Eur J Orthod, 2006,28:221-240.

[4]P.Z.Khasigov1,O. V.Podobed1,S. A.Ktzoeva1Matrix Metalloproteinases of Normal Human Tissues Biochemistry (Moscow),Vol. 66, No.2, 2001, pp. 130-140. Translated from Biokhimiya, Vol. 66, No. 2, 2001, pp. 167-179.

[5]Sajal Chakraborti, Malay Mandal, Sudip Das. Regulation of matrix metalloproteinases: An overview Molecular and Cellular Biochemistry,2003,253:269-285.

[6]庄 丽,白玉兴,李俊发.龈沟液中基质金属蛋白酶-9含量与正畸牙根吸收相关性的实验研究[J].北京口腔医学,2007,15(2):65-68.

[7]于世凤.口腔组织病理学[M],5版.北京:人民卫生出版社,2003:76-78.

[8]张晓东,林 珠,李永明,等.III型胶原和基质金属蛋白酶-1在大鼠移动牙齿牙周组织中的表达[J].口腔医学,2005,25(5):257-259.

[9]Gao J,Symons AL,Bartold PM.Expression of transforming growth factor beta receptors types II and III within various cells in the rat periodontium[J].J Periodontal Res,1999,34(2):113-122.

[10]Dong-Seok Nahm,Hee-Jeong Kim,James Mah.In Vitro expression of matrix metalloproteinase-1,tissue inhibitor of metalloprpteinase-1 and transforming growth factor-β1 in human periodontal ligament fibroblasts[J].EurJOrthod,2004,26:129-135.

[11]Wrana JL,Overall CM,Sodek J.Regulation of the expression of a secreted acidic protein rich in cysteine ( SPARC) in human fibroblasts transforming growth factor beta comparison of transcriptional and post-transcriptional control with fibronectin and type I collagen[J].Eur J Biochem,1991,197(2):519-528.

[12]Karina Gonzales Silverio-Ruiz a,Aurora Esmeralda Traverso Martinez a,Gustavo Pompermaier Garlet bOpposite effects of bFGF and TGF-b on collagen metabolism by human periodontal ligament fibroblasts [J].Cytokine, 2007,39:130-137.

[13]李永明,林 珠,冯 雪,等.MMP-3和TIMP-1在正畸牙周组织改建过程中的表达[J].实用口腔医学杂志,2000,16(6): 417-419.

[14]Shimazu A,Morishita M.Basic fibroblast growth factor induces the expression of matrix metalloproteinase-3 in human periodontal ligament cells through the MEK2 mitogen-activated protein kinase pathway[J].J Periodont Res,2003,38:122-129.

[15]Zhao ZH, Fan YB, Bai D.The adaptive response of periodontal ligament to orthodontic force loading-A combined biomechanical and biological study [J].Clinical Biomechanics,2008,23:S59-S66.

[16]Ichiro Takahashi,Kazuyuki Onodera,Makoto Nishimura.Expression of genes for gelatinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in periodontal tissues during orthodontic tooth movement[J].J Mol Hist,2006, 37:333-342.

[17]S. Apajalahti, T. Sorsa, S. Railavo.The in vivo levels of matrix metalloproteinase-1 and -8 in gingival crevicularfluid during initial orthodontic toothmovement[J].J Dent Res,2003,82(12):1018-1022.

[18]Slawomir M.Wojtowicz-Praga,Robert B.Dickson and Michael J.HawkinsMatrix metalloproteinase inhibitors[J].Investigational New Drugs,1997,15:61-75.

[收稿日期]2009-11-20 [修回日期]2010-01-25