ABC-ELISA定量测定红细胞趋化因子受体及其意义

作者：张乐之，卢晓丹，龚燕芳，郭 峰

【摘要】 目的 建立ABC-ELISA定量测定红细胞趋化因子受体(ECKR)的方法并探讨其临床意义。方法 分离一定数量红细胞与IL-8结合，离心后取上清液用ABC-ELISA法检测IL-8含量，通过公式计算红细胞趋化因子受体结合活性；对该法检测IL-8的灵敏度、精密度、准确度进行了探讨，并对31例正常人，25例恶性肿瘤患者和33例银屑病患者的ECKR进行了测定。结果 该法检测IL-8的灵敏度为15.6pg/ml。精密度批内平均CV 4.69%；批间平均CV 9.79%，准确度平均回收率为97%。31例正常人ECKR为(52.96±10.45)%；25例恶性肿瘤ECKR为(46.07±13.33)%；33例银屑病人ECKR为(46.87±10.28)%。经统计，恶性肿瘤患者和银屑病患者ECKR均比正常人ECKR要低(P<0.05)。结论 该法是一种简便的定量测定ECKR的新方法，对研究红细胞免疫、趋化因子及其受体在疾病防治和发病机理中的作用有一定价值。

【关键词】 红细胞趋化因子受体；链霉亲和素生物素-ELISA；白介素-8；红细胞免疫

【Abstract】 Objective To develop a quantitative ABC-ELISA and to investigate the clinical significance for human erythrocyte chemokine receptor.Methods Isolated erythrocytes bound to IL-8. After centrifuge IL-8 levels were measured with ABC-ELISA in the supernatant. Activity of erythrocyte chemokine receptor were calculated by formula.Results The minimum detectable limit was 15.6pg/ml. Precision： The mean coefficients of variation were 4.69% for inter-assay and 9.79% for intra-assay， respectively. Accuracy： The mean recovery rate was 97%. In 31 normal adults， the ECKR binding activity (±s%) was 52.96±10.45. In 25 tumors， 33 psoriasises， it was 46.07±13.33， 46.87±10.28 respectively. The ECKR binding activity of the tumors and the psoriasises decreased significantly (P<0.05) compares with normal control group by statistics.Conclusion A quantitative ABC-ELISA for erythrocyte chemokine receptor is a simple and new method. The detection of the ECKR binding activity has a value to study RBC immune， chemokine and its receptor in preventing， treating and the pathogenesis of the disease.

【Key words】 erythrocyte chemokine receptor；ABC-ELISA；interleukin-8；erythrocyte immune

1982年郭峰［1］在国内首先建立了测定红细胞免疫粘附功能的方法，并证明红细胞的免疫粘附功能主要是通过CR1实现的。该法简便易行，沿用至今。二十年来，红细胞免疫研究逐渐深入，已发现红细胞表达多种天然免疫受体和物质，如CR1、CR3、CD44、CD58、CD59、DAF、SOD酶和趋化因子受体(CKR)等，其中每个红细胞上的红细胞趋化因子受体(ECKR)表达的数量比CR1要多［2］，但对ECKR的作用却知之甚少。因此我们建立了ABC-ELISA定量测定ECKR方法并初步应用于临床，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要实验试剂和仪器 人重组白介素-8(IL-8)纯品(北京医科大学分子免疫室产品)；人链霉亲和素生物素-ELISA(ABC-ELISA)试剂盒(法国Diaclone公司产品)；微晶纤维素(上海赵屯药厂产品)；α-纤维素(浙江湖州食品化工联合公司产品)；淋巴细胞分离液(上海试剂二厂产品)；酶标仪(芬兰Labsystems公司制造)。

1.1.2 实验对象 采自本院体检健康者和门诊或住院患者。正常对照组31例，男21例，女10例，平均年龄33岁；银屑病患者33例，男22例，女11例，平均年龄43岁；恶性肿瘤患者25例，男13例，女12例，平均年龄50岁。

1.2 方法

1.2.1 红细胞分离柱制备 取玻璃滴管，装入少许脱脂棉花，再加入用生理盐水配成的α-纤维素/微晶纤维素(1：1，W/W)，柱高约1cm，最后加入生理盐水，如生理盐水能滤过，分离柱即可使用。

1.2.2 红细胞悬液制备 取枸橼酸钠抗凝新鲜血1ml，淋巴细胞分离液分离后取沉底红细胞，用生理盐水约作稀释后加入红细胞分离柱，最后再用生理盐水将红细胞洗涤下来，收集的红细胞悬液用涂片镜检法或白细胞计数法证实不含白细胞，将此悬液用生理盐水配成含红细胞数量为3.0×1012/L。

1.2.3 人重组IL-8应用液制备 取人IL-8 ABC-ELISA试剂盒中标准品稀释液1ml溶解人重组IL-8(10μg/ml)，再作1：20稀释即为应用液，分装保存-20℃备用。

1.2.4 ECKR与IL-8结合反应 在待测样本管中分别加红细胞悬液100μl，pH7.4 PBS缓冲液(含1%BSA)100μl，人重组IL-8应用液100μl；在阳性对照管中分别加pH7.4 PBS缓冲液(含1%BSA)200μl，人重组IL-8应用液100μl。将以上试管轻轻混匀并盖上纱布，放37℃水箱孵育15min(中途轻轻摇匀一次)，取出离心(2000r/min)5min，吸上清100μl，即刻检测IL-8含量或置-20℃待测。

1.2.5 灵敏度试验 取ABC-ELISA试剂盒中的IL-8标准品用标准品稀释液作倍比稀释后测定IL-8含量。

1.2.6 精密度试验 取人胃粘膜活检物培养上清液，测其IL-8含量，留取高、中、低浓度IL-8上清液共6份，其中3份作批内重复试验各测10孔；另3份作批间重复试验每周测1次，共各测10次。

1.2.7 准确度试验 取ABC-ELISA试剂盒中高、中、低浓度IL-8标准品作回收试验，计算平均回收率。

1.2.8 ECKR结合活性测定 从冰箱取出IL-8 ABC-ELISA试剂盒平衡至室温，操作步骤为：分别取以上样本管和阳性对照管上清100μl加入对应酶标板孔中，每孔再加50μl已稀释的生物素化抗体，将酶标板放室温反应1h后洗板3次，在每孔中再加入100μl HRP标记的链霉亲和素，室温反应30min后洗板3次，每孔加100μl TMB显色液，避光显色12～15min后每孔加100μl终止液，立即在450nm波长的酶标仪上比色测定OD值。ECKR结合活性=(阳性对照管OD值-样本管OD值)/阳性对照管OD值×100%。

2 结果

2.1 灵敏度 该法测定IL-8的最低浓度可达15.6pg/ml。

2.2 精密度 批内重复试验结果：对高浓度(IL-8含量为1658pg/ml)上清液测定的CV值为2.12%，中浓度(IL-8含量为758pg/ml)上清液测定的CV值为4.71%，低浓度(IL-8含量为135pg/ml)上清液测定的CV值为7.23%，平均CV值为4.69%。批间重复试验：3份培养上清液的IL-8含量为1763pg/ml、827pg/ml、168pg/ml，其对应CV值分别为13.64%、9.51%、6.21%，平均CV值为9.79%。

2.3 准确度 回收试验结果：IL-8标准品浓度分别为1000pg/ml、500pg/ml、62.5pg/ml，其对应回收率分别为89%、95%、107%，平均回收率为97%。

2.4 测定结果 正常对照组、银屑病患者及恶性肿瘤患者ECKR结合活性测定结果见表1。 表1 各组ECKR结合活性检测结果 (%，x±s)

注：与正常人组比较*P<0.05

3 讨论

在传统的酶免疫测定技术中，反应物与固相的结合常常是有限和不够充分的。尤其是实验过程中经历多次冲洗步骤、长时间温育、温度高及采用了含表面活性剂的缓冲液时，会出现解吸附。由于解吸附作用，使得这类免疫测定法的灵敏度、精密度和准确度均受到影响。

ABC-ELISA是通过链霉亲和素-生物素捕获系统将抗体、抗原或免疫复合物间接地固定于固相之上的测定方法。该法中链霉亲和素是一种大分子量(60000道尔顿)寡聚蛋白，等电点为7.0，每个分子含有四个相同的亚基，每个亚基均有一个生物素结合位点。链霉亲和素复和物结合常数为1015L/mol，比经典的抗原-抗体复合物的结合常数高100万倍以上，是目前所知最强的非共价相互作用。该法中的生物素也叫维生素H，为一小分子物质(240道尔顿)，能与各种大分子结合，结合后它的其它生物学活性或与其它分子的特异相互作用不发生改变。它与链霉亲和素的专一结合能力甚至在不利的反应条件下也不会受到影响。由于这两种分子间的高亲和力，使得它们形成的复合物在强烈的清洗条件下、pH变化或其它化学变化中都不会发生解离。因而，为利用该法检测各种物质提供了较好的质量保证。本文方法测定IL-8的灵敏度可达15.6pg/ml，精密度为批内平均CV值4.6%，批间平均CV值9.79%，准确度为平均回收率97%，是一种灵敏度高，测定结果较准确稳定的简便方法。

CKR与CK在体内构成了一个复杂的网络。其主要作用是作为特定细胞，如中性粒细胞、单核细胞、T淋巴细胞的趋化剂和活化剂，参与多种免疫和炎症反应。在红细胞上表达的CKR称为ECKR，ECKR不仅存在于红细胞、中性粒细胞和淋巴细胞，还表达在脑、肾、肺和胸腺。它是一种多配体的受体，既可结合IL-8、MGSA，又可结合MCP-1和RANIES，它还是间日疟原虫的受体，每个红细胞上约有1000～9000个这种受体，并证实该受体就是血型D抗原［4～6］。本文结果表明恶性肿瘤患者和银屑病人ECKR结合活性降低，提示红细胞参与了这些疾病的发病过程，值得深入研究。

目前对ECKR的生物学作用，与其它免疫细胞和细胞因子的相互关系，以及在各种疾病中的病理作用机理存在许多未知数。我们期待ABC-ELISA定量测定ECKR方法的建立可为基础和临床研究提供新手段，并为国内红细胞免疫研究开辟新的途径。

【参考文献】

1 郭峰，虞紫茜，赵书平.红细胞免疫功能的初步研究.中华医学杂志，1982，12：715.

2 Darbonue WC， Rice GC， Mohler MA， et al. Red blood cells are a sink for interleukin 8， A leukocyte chemotaxin. J Clin lnvest， 1991， 4：1362.

3 Horuk R， Chitnis CE， Darnonne WC， et al. A receptor for the maiarial parasite plasmodium vivax： the erythrocyte chemokine receptor. Science， 1993， 5125：1182.

4 Neote K， Darbonne WC， Ogez J， et al. ldentification of a promiscuous inflammatory peptide receptor on the surface of red blood cells. J Biol Chem， 1993， 17：12247.

5 Luster AD， Leder P. IP-10， a-C-X-C chemokine， elicits a potent thymusdependent antiyumor respone in vivo. J Exp Med， 1993， 178：1057.

6 Chiao H， Foster S， Thomas R， et al. A-Melanocyte-stimulating hormone reduces endotoxin induced liver inflammation. J Clin Invest， 1997， 9：2038.