纸层析分离鉴定氨基酸实验的改进

摘要: 采用纸层析分离鉴定5种不同的氨基酸，对传统《基础生物化学实验》中的“氨基酸的分离鉴定――纸层析法”进行了改进，同时又与薄层层析分离鉴定氨基酸进行比较.结果表明，在进行氨基酸的分离鉴定时，改进的纸层析法比传统的纸层析法具有耗材少，时间短等优点；而薄层层析法又比纸层析法有更多的优越性，具有速度更快、斑点更集中、显色灵敏度更高等优点.

关键词: 纸层析；薄层层析；氨基酸；Rf值

中图分类号:Q 503 文献标志码:A 文章编号:1672-8513(2011)03-0229-03

Improvement of the Method on Amino-Acid Isolation and Identification by Paper Chromatography

YANG Li1, YOU Li1, YE Jinxiu1, YUAN Yan1,2

(1.Key Laboratory of Ethnic Medicine Resource Chemistry, State Ethnic Affairs Commission & Ministry of Education,School of chemistry and Biotechnology, Yunnan University of Nationalities，Kunming 650031, China; 2. Department of Life Science and Technology, Kunming University, Kunming 650031, China)

Abstract: Five kinds of different amino acids were isolated and identified by paper chromatography. The traditional experiment of "Isolation and Identification of Amino Acids Using Paper Chromatography" in the book of "Basic Biochemical Experiments" was improved. And the isolation and identification of amino acids were compared by the paper and thin-layer chromatography. The results showed that the method of improvement paper chromatography had fewer wastes and shorter time than the traditional paper chromatography on the amino acids isolated and identified. And the thin-layer chromatography method has more advantages than the paper chromatography with faster and higher sensitivity.

Key words: paper chromatography; thin-layer chromatography; amino acids; Rf value

纸层析是利用样品各组分在固定相和流动相中分配系数的不同，从而使各组分达到分离的层析技术，广泛应用于氨基酸、蛋白质、染料、色素和中草药等物质的分离和鉴定［1-3］.在“基础生物化学实验”（第2版,高等教育出版社)，“氨基酸的分离鉴定――纸层析法”是学生实验的重要内容，但是按照该教材上的要求操作，比较烦琐，整个实验的时间很长［4］.因此，为了提高教学效果，我们对此实验作了改进，同时又与薄层层析作了比较，效果比较好.

1 材料与方法

1.1 材料

层析滤纸(新华一号)、薄层板、烧杯(250mL)、表面皿、吹风机、点样毛细管、镊子、剪刀、尺和铅笔.

1.2 试剂

0.5%的氨基酸溶液(赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸)及其混合液（各组份浓度均为0.5%）；展层剂V（正丁醇）∶[KG-*2]V（冰醋酸）=4∶1）；显色剂（0.1%水合茚三酮正丁醇溶液）.

1.3 方法

1.3.1 传统纸层析法分离鉴定氨基酸的改进［5-6］

1) 滤纸的准备.用剪刀将滤纸剪成宽约6cm，长约10cm大小，在纸的一端距边缘2～3cm处用铅笔划一条直线，平均分成6个点.

2) 点样.用毛细管吸取少量0.5%氨基酸样品分别点在这6个位置上，每点完一点，立刻用电吹风热风吹干后再点一次，每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm.

3) 展层.在250mL的烧杯中倒入少量的展层剂（液面为1cm左右），用镊子将点好样的滤纸小心放入烧杯中，使之直立，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线，盖上表面皿.待溶剂上升至9cm左右时，用镊子将滤纸取出，用铅笔画出溶剂前沿，自然干燥或用吹风机吹干.

4) 显色.用喷雾器向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，立即用吹风机吹干，即可显出各层析斑点.

5) Rf值的计算.用直尺量出每个样品从原点到层析斑点中心的距离和从原点到溶剂前沿的距离，计算各样品的Rf值.

1.3.2 薄层层析法分离鉴定氨基酸［7-8］

薄层层析法分离鉴定氨基酸与改进的纸层析法相似，将滤纸改成薄层板，具体操作如下：

1) 铺制薄层板.薄层板可以直接购买，也可以自己制作.铺制薄层板的过程为：将吸附剂1份和水2.5~3.0份（或加入黏合剂的水溶液）在研钵中向一方向研磨混合，去除表面的气泡后，进行涂布（厚度为0.2～0.3mm），颠板，于室温下，置水平台上晾干，在反射光及透视光下检视，表面应均匀，平整，无麻点、无气泡、无破损及污染，于100~110℃烘30min，冷却后立即使用或置干燥箱中备用.

2) 点样.将薄层板铺有硅胶部分平放在干净的桌面上，用石英刀将薄层板切成宽约4cm，长约6cm大小，在薄层板的一端距边缘约2cm处用铅笔划一条直线，平均分成6个点.用毛细管吸取少量0.5%氨基酸样品分别点在这6个位置上，每点完一点，立刻用吹风机吹干后再点一次，每点在纸上扩散的直径最大不超过3mm.

3) 展层.在烧杯中倒入少量的展层剂（液面为1cm左右），用镊子将点好样的薄层板小心放入烧杯中，使之直立，点样的一端在下，扩展剂的液面需低于点样线.盖上盖子，待溶剂上升至5cm左右时，用镊子将滤纸取出，自然干燥或用吹风机吹干.

4) 显色.用喷雾器向滤纸上均匀喷上0.1%茚三酮正丁醇溶液，然后立即用吹风机吹干，即可显出各层析斑点.

5) Rf值的计算.用直尺量出每个样品从原点到层析斑点中心的距离和从原点到溶剂前沿的距离，计算各样品的Rf值.

2 结果与分析

2. 1 改进纸层析法分离鉴定氨基酸

在宽约6cm×10cm滤纸的一端距边缘2～3cm处平均点0.5％的赖氨酸（1）、脯氨酸（2）、缬氨酸（3）、苯丙氨酸（4）、亮氨酸（5）溶液及它们的混合液（6），共6个样品，展层后，用0.1%茚三酮正丁醇显色，吹干，显示出各层析斑点，结果如图1.

2. 2 纸层析法Rf值的计算结果

用直尺分别量出赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸样品从原点到层析斑点中心的距离（x）和从原点到溶剂前沿的距离（y），计算各样品的Rf值（Rf=x/y）.

2. 3 薄层层析法分离鉴定氨基酸

在宽约4cm×6cm薄层板的一端距边缘约2cm处平均点0.5％的赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液，共6个样品，展层后，用0.1%茚三酮正丁醇显色，吹干，显示出各层析斑点，结果如图2所示.

2.4 薄层层析法Rf值的计算结果

用直尺分别量出赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸样品从原点到层析斑点中心的距离（x）和从原点到溶剂前沿的距离（y），计算各样品的Rf值（Rf=x/y）.

3 结语

本文采用纸层析法分离鉴定赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液，对传统“基础生物化学实验”中的“氨基酸的分离鉴定――纸层析法”进行了改进.结果表明，改进的纸层析法所需的滤纸比较小，不需要用针线将滤纸做成圆筒形，也不需要先放一个装有展层剂的小烧杯预平衡整个大层析缸［9-10］.所以整个实验操作过程中，改进的纸层析法比传统的纸层析法具有耗材少，时间短等优点.从图1和图2的结果可以看出，在进行氨基酸的分离鉴定时，薄层层析法又比纸层析法有更多的优越性，具有速度更快、斑点更集中、显色灵敏度更高等优点.

溶质在支持物上移动的速率可用Rf值表示，影响Rf值的因素很多，主要受物质的结构和极性、支持物、层析所用溶剂、温度、展开方式、pH值及样品溶液中杂质的影响［11］.本文表1和表2中Rf值有些差异，本实验是在相同条件下操作的，不同的是一个是采用纸层析，另一个采用的是薄层层析，故本文中影响Rf值最主要的因素是由于支持物的不同而造成的.

参考文献:

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［11］郭勇. 现代生化技术 ［M］. 2版.北京: 科学出版社, 2005, 55-63.

收稿日期:2010-11-22.

基金项目:云南省应用基础研究面上项目(2009CD154)；民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室基金(MZY100101).

作者简介:杨丽(1982-),女,助教.主要研究方向:生物化学.

通讯作者:袁燕(1975-),女,博士,副教授.主要研究方向:生物有机化学.