滴水珠原生质体的分离纯化与植株再生

[摘要] 以滴水珠的幼嫩叶片为材料，对影响原生质体分离纯化、培养及植株再生的因素进行了研究。结果表明：适合滴水珠叶片的酶解体系为13% CPW（细胞原生质体洗液）+1.0% 纤维素酶+ 0.1% 果胶酶，pH 6.0，适宜酶解温度为25～28 ℃，酶解时间为4 h；滴水珠叶肉原生质体纯化以上浮法蔗糖梯度离心效果最佳，以25%的蔗糖做梯度材料，500 r・min-1离心10 min；用于培养滴水珠原生质体的培养基为MS+0.5 mg・L-1 6-BA+0.25 mg・L-1NAA 13%甘露醇，培养3 d有细胞分裂启动迹象，30 d左右形成愈伤组织，转移至MS +0.5 mg・L-1 6- BA+0.25 mg・L-1NAA固体培养基上增殖培养，并继代数次，5～6个月后愈伤组织可分化出芽并再生植株。

[关键词] 滴水珠；原生质体分离；植株再生

植物原生质体是指去除了全部细胞壁的细胞，或是一个被质膜所包围的具有生活力的“细胞”；是植物遗传工程的理想受体和细胞生物学与遗传学等基础理论研究的理想材料[1]。滴水珠为天南星科半夏属植物心叶半夏Pinellia cordata N.E.Br的干燥块茎，具有解毒消肿，散瘀止痛等功效，常用于毒蛇咬伤、肿毒、头痛、胃痛、跌打损伤等。滴水珠具有良好的药理作用，因此受到了广泛的关注。国内外学者对其在人工栽培及生物学特性等方面做了研究，但对滴水珠原生质体的分离与植株再生的报道较少[2-4]。本研究以滴水珠叶片为材料，探讨了影响原生质体分离、培养的因素，并培养获得愈伤组织，建立滴水珠再生体系，为滴水珠原生质体遗传转化和细胞融合提供科学依据。

1 材料

滴水珠幼嫩叶片，采自浙江临安，由浙江中医药大学生命科学学院丁志山教授鉴定。

2 方法

2.1 酶液的配制

13% CPW：27.2 mg・L-1 KH2PO4，101.1 mg・L-1 KNO3，1.66 mg・L-1 KI，1 110.0 mg・L-1 CaCl2，246 mg・L-1 MgSO4.7H2O，0.255 mg・L-1 CuSO4・5H2O，130 g・L-1甘露醇，115 ℃，高压灭菌30 min，备用。在无菌CPW中加入纤维素酶和果胶酶，将pH调至5.8，经0.2 μm微孔滤膜过滤除菌，备用。

2.2 原生质体的分离、纯化及活力测定

2.2.1 材料预处理 将滴水珠幼嫩叶片置于4 ℃冰箱中，黑暗预处理24 h，然后取0.5 g，用眼科剪各剪成1 mm×1 mm见方的碎片，置于13% CPW +1.0% 纤维素酶+1.0% 果胶酶的pH为6.8的混合酶液中，25 ℃慢速摇床（50～60 r・min-1）上黑暗酶解，重复3次。酶解产物经200目尼龙网依次过滤，700 r・min-1离心5 min，用新鲜洗液洗涤3次，收集原生质体，纯化后进行原生质体产量和活力的统计。

2.2.2 最佳酶液的筛选 采用正交试验L9（34）对酶液酶种的组成、用量及pH进行优化考察，重复3次，见表1。

酶解产物经200目尼龙网依次过滤，700 r・min-1离心5 min，用新鲜洗液洗涤3次，收集原生质体，纯化后进行原生质体产量和活力的统计。

2.2.3 酶解温度和酶解时间的筛选 最佳酶解液酶解2 h后，每隔1 h在倒置显微镜下观察原生质体酶解情况并计数，直至8 h；最佳混合酶液分别设定20，25，28，30，33 ℃ 5个温度梯度，测定不同温度下原生质体的分离和收集情况。每个处理重复3次。

2.2.4 原生质体的纯化条件优化 采用蔗糖等密度离心法的上浮法对原生质体进行纯化，蔗糖浓度设定为25%，30%，35%（115 ℃高压蒸气灭菌30 min），洗涤后的原生质体用1 mL洗液悬起，轻轻铺于3 mL蔗糖上层，设定3个离心条件500 r・min-1，10 min；700 r・min-1，7 min；1 000 r・min-1，5 min，离心后用无菌滴管小心吸取中间条带。

2.2.5 原生质体计数和活力测定 采用血球计数板计数，每个样本重复计数5次，每个处理重复3次。

原生质体密度=16个大格内原生质体总数平均数×104×稀释倍数；

原生质体产量=原生质体密度（个/mL ）×稀释后体积（mL）/叶片质量（g）

FDA染色：取纯化并清洗后原生质体悬浮液，置于小离心管中，加入现配的FDA丙酮溶液使其终浓度为1.5～2 mg・L-1，混匀置于暗处2 min，700 r・min-1离心5 min，弃去上清，沉淀用13% CPW悬起并稀释至适宜浓度，用荧光显微镜（OLYMPUS 1×71）观察并拍照，用蓝色激发光激发，发绿色荧光的为有活力的原生质体，发红色荧光的为无活力的原生质体。每个处理组重复3次，每重复一次统计5个视野，取平均值。

原生质体活力=（发绿色荧光的原生质体数目/原生质体总数）×100%

2.3 原生质体培养

2.3.1 不同培养基对叶片原生质体分裂的影响 对4种培养基（B5，N6，MS，改良MS）进行了筛选，将纯化后的原生质体以5×104个/mL，接种于培养基中，每皿接种2 mL，用PARAFILM封口，每种浓度处理5皿，暗处静置培养，温度（25±1） ℃。

2.3.2 不同激素浓度对叶片原生质体分裂的影响 对适宜的原生质体培养基进行改良，在添加了不同浓度2，4-D+KT组合、6-BA+NAA组合的培养基上，以5×104 个/mL的培养密度进行培养，激素配比见表2。

每隔7 d，对每个培养皿添加相应的新鲜液体培养基0.5 mL，前2次添加含有渗透剂的液体培养基，以后每次添加除去渗透剂的原生质体培养基。

2.3.3 植株再生 将纯化后得到的原生质体，稀释至较低的不同密度（100～500个/mL），按照原生质体培养同步筛选出的最佳培养基及激素组合，依次采用下面培养方法进行培养：半固体培养看护（条件培养基）；液固双层培养（愈伤组织看护培养）。待愈伤织增大为直径2～3 mm时，及时转移到新的固体培养基上进行愈伤的增殖和分化培养。

2.4 数据处理

实验结果以±s的形式表示，计数资料采用方差检验，计量资料采用t检验。

3 结果与分析

3.1 叶肉原生质体的游离

3.1.1 预处理对原生质体产量和活力的影响 在滴水珠叶片酶解前，对叶片进行低温黑暗预处理，并以未处理组作为对照。酶解得到的原生质体产量和活力见表3。

从表3可以看出，低温黑暗预处理并没有使原生质体的产量和活力增加，相反，均明显的有所下降，故后续实验并不对叶片材料采取低温黑暗预处理。

3.1.2 最佳酶液组合的筛选 本研究采用正交试验设计配制酶液，对滴水珠叶肉原生质体游离的最佳酶液组合进行筛选，各20 mL酶液配制实际称样量和pH及酶解得到的原生质体产量结果见表4，纤维素酶是影响滴水珠叶片原生质体游离产量最重要的酶种，而果胶酶的影响最小。各因子对滴水珠叶片原生质体游离产量影响的大小顺序为纤维素酶>pH >果胶酶，较优水平组合为4号。

3.1.3 酶解时间对滴水珠叶片原生质体分离的影响 随着酶解时间的延长，原生质体产量不断提高，其存活率则有逐步降低的趋势。当酶解时间为4 h时，原生质体的产量达到最高；此后，随着时间的延长，原生质体产量不但不提高，反而逐渐下降，且其存活率也下降。故4 h为最佳酶解时间，产量和活力均最高，此时可以收集和纯化原生质体，见图1。

3.1.4 酶解温度对滴水珠原生质体游离的影响 相对较低的酶解温度（25，28 ℃），原生质体的产量较高，但在30 ℃或更高时，产量明显下降；酶解温度为28，30 ℃时，原生质体活力较高，而温度较低（20，25 ℃）或较高（35 ℃），游离原生质体的活力仅略有降低。因此，滴水珠叶片原生质体游离时，选择28 ℃为酶解温度较为适宜，见图2。

3.2 原生质体的纯化

3.2.1 蔗糖浓度选择 蔗糖梯度离心法对滴水珠叶片游离得到的原生质体进行纯化，分别设定20%，25%，30%，35% 4个梯度，离心条件均为500 r・min-1，10 min，纯化结果见表5。

从纯化结果观察及表5数据可知，20%的蔗糖浓度较小，离心后没有出现原生质体的中间条带，25%的蔗糖纯化得到的原生质体产量及活力均较高，35%的蔗糖浓度产量和活力均相对最低，而且30%，35%的蔗糖纯化后碎片较多，25%的蔗糖纯化后几乎均圆整。因此，确定以25%的蔗糖作为梯度离心的材料。

3.2.2 离心速率和时间 蔗糖梯度离心法对滴水珠叶肉原生质体进行纯化，蔗糖均为25%，分别设定500 r・min-1，10 min；700 r・min-1，7 min；1 000 r・min-1，5 min 3个离心条件，编号为L1，L2，L3，纯化结果见表6。

从表6可知，离心条件L1（即500 r・min-1，10 min）纯化原生质体，收集的原生质体产量最高，活力也较高，且显微观察发现悬液中碎片较少，故本实验以500 r・min-1离心10 min来纯化原生质体。

3.2.3 原生质体计数及活力的测定 用血球计数板进行计数并计算原生质体的产量和活力；用FDA染色后，置于荧光显微镜下观察并拍照结果见图3。

3.3 原生质体的培养及植株再生

3.3.1 培养基的筛选 在4种添加了生长调节剂及13%甘露醇的培养基中培养原生质体，结果表明，仅在自制的MS上于培养的第3天少量细胞开始分裂，第4天更多细胞启动分裂，第7天形成几个细胞组成的细胞团并持续分裂，见图4。在其他培养基中并无观察到细胞分裂现象；添加了2，4-D+KT组合的培养基上，细胞分裂的数量很少并出现了非对称性分裂，且随着培养时间的延长，启动分裂的细胞并没有明显增多，而6-BA+NAA组合的2个浓度变化并没有引起原生质体明显的生长差异，故本实验选择了MS+0.5 mg・L-1 6-BA+0.25 mg・L-1 NAA+3%蔗糖+13%甘露醇作为原生质体的培养基。

3.3.2 植株再生体系的建立 原生质体培养的第1～2天开始再生新的细胞壁，第3天开始启动分裂，第7天形成细胞团，并添加新鲜的附加7%甘露醇的半固体条件培养液，第15天细胞团明显变大，见图5。转移至固体培养基中并接入直径2～3 mm愈伤组织块进行饲喂培养，逐渐出现肉眼可见的愈伤并不断地分裂变大，多次转移至相应的新鲜固体培养基，直至分化培养、再生植株。

4 讨论

植物原生质体培养过程中，起始材料是影响植物原生质体分离培养和植株再生的重要因素[5]。Power等[6]报道，酶解前对材料进行暗处理，有利于原生质体产量的提高。是否需要预处理要根据材料不同等情况而定。由于预处理后，滴水珠游离原生质体的产量和活力均明显降低，因此，滴水珠叶片不宜进行预处理。使用叶片分离原生质体的过程中，叶片表皮会阻挡酶液渗透到叶肉组织中，无菌操作充分撕去下表皮比较困难，而将叶片快速地剪碎则比较均匀可行[7-8]。本实验用眼科剪将幼嫩的滴水珠叶片迅速剪成1 mm×1 mm见方的碎片，于28 ℃慢速摇床（50 r・min-1）上黑暗酶解，仅4 h，产量可达5.1×105个/g。表明，对滴水珠叶片进行适当的切割处理，能大幅度提高原生质体的产量，并大大缩短酶解时间。

酶液的组成、浓度配比、酶解温度和时间对原生质体分离有很大的影响[9]。本实验采用1.0%纤维素酶+0.1%果胶酶+13% CPW配制的酶液组合（pH为6.0），于28 ℃酶解4 h，滴水珠原生质体的产量为5.1×105个/g，活力大于75%，符合原生质体培养和细胞融合的标准，为下一步实验奠定基础。

本研究以25%蔗糖等密度上浮离心法纯化滴水珠原生质体，500 r・min-1离心10 min，获得滴水珠原生质体产量高达5.1×105个/g。

在一定范围内， 原生质体具有较强的恢复分裂能力，一般密度以5×104～1×105个/mL为宜[10]。本实验比较了4种用于培养滴水珠原生质体的培养基，在MS干粉培养基上培养没有观察到细胞分裂 结果，仅自制的MS获得了较好的滴水珠植株再生效果。

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Protoplasts isolation， purification and plant regeneration of

Pinellia cordata

YANG Xian， MA Dan-dan， JIANG Fu-sheng， CHEN Ni-pi， DING Bin， JIN Li-xia， QIAN Chao-dong， DING Zhi-shan*

（College of Life Science， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China）

[Abstract] The main factors which affected the isolation， purification and cultivation of Pinellia cordata protoplasts from leaves were studied. The results indicated that the optimum enzyme solution for P. cordata leaves was 13% CPW+ 1.0% Cellulose+0.1% Pectolase， at pH 6.0， temperature （25-28 ℃） for 4 h. The sucrose density gradient centrifugation was adopted to purificate the protoplasts collected， when 25% sucrose was used as mediator， centrifugating at 500 rpm for 10 min. When the protoplasts were shallow liquid and liquid-solid double layer cultured on the medium of MS+0.5 mg・L-1 6-BA+0.25 mg・L-1 NAA+13% mannitol at the density of 2.5×104 protoplasts/mL， or fed and nursed cultured at the density of 100-500 protoplasts/mL， cell division could be observed for 3 days； granular calli appeared for 30 days. Calli was proliferated on the medium of MS+0.5 mg・L-1 6-BA+0.25 mg・L-1 NAA solidified by 0.55% agar， and differentiated and regenerated after 5-6 months. Plant generation of P. cordata is successfully established.

[Key words] cordate pinellia tuber； protoplasts isolation； plant regeneration

doi：10.4268/cjcmm20142124