转化生长因子-β1及其Smad信号通路在肝纤维化中的研究进展

【摘要】 转化因子β1是最强的致肝纤维化因子,有多种生物学功能,其主要通过TGF-β1/Smads信号转导通路发挥生物学效应,并与其他信号通路之间存在交互作用,深入研究TGF-β1/Smad信号转导通路可进一步阐明肝纤维化的发病机制,为防治肝纤维化提供新的有效方法。

【关键词】 转化因子β1 信号转导 肝纤维化 肝星状细胞

肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是在各种慢性致病因素,如肝炎病毒、酒精、胆汁淤积、毒物、代谢性及自身免疫性疾病等作用下,肝细胞发生炎性损伤或坏死,使得细胞外基质(extracellular matrix ECM)的合成与降解失衡,导致肝内纤维结缔组织异常沉积、肝小叶结构变形或假小叶形成的病理过程。现代医学认为肝星状细胞(hepatic stellate cell HSC)的活化、增生及转型是肝纤维化发生的中心环节[1],王伟[2]等认为HSC的活化也参于了原发性肝癌发生发展的早期事件。肝纤维化逐渐发展至肝硬化,其结局往往为肝功能衰竭或导致原发性肝癌,但肝纤维化是一个可逆性的病理过程,早期进行抗纤维化干预可减缓甚至完全逆转肝纤维化,也可以预防原发性肝癌的发生。转化因子β1 (transforming growth factorβ1 TGF-β1)主要由活化的HSC自分泌产生,促进HSC活化,增加ZCM合成并抑制其降解等作用,已被公认为在肝纤维化的发生、发展中最重要的致纤维化因子[3],本文就对转化因子―β1及其信号转导通路在肝纤维化中作用,并就干扰TGF-β1/Smad信号转导通路在抗纤维化中的研究进展作一综述。

1 转化因子β家族及受体

1.1 转化因子β家族 TGFβ属于二聚多肽类的生长

因子家族,其超家族中目前研究报道的有6种TGFβ因子,分别为TGFβ1―6,而在哺乳动物中表达并已克隆的是TGF1―3,在TGF因子中, TGF-β1是目前研究最多的与器官纤维化发生发展密切相关的细胞因子,在肝脏中,TGF-β1是最主要成分,其含量约为TGFβ2和TGFβ3的10倍。

1.2 转化因子β1的受体 TGF-β1的生物学作用是通过细胞膜上的特异受体介导的,目前发现有三种明显不同的膜结合受体的与TGF-β1特异结合,亲和力很高,分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型,这三种受体类型由位于不同染色体上的基因编码,它们在氨基酸序列上有80%的同源性,Ⅰ、Ⅱ型受体是糖蛋白,它们均为跨膜的丝氨酸/苏氨酸激酶,二者结构相似,由一个细胞外配体结合链和细胞内可传递信号的酶结构组成,未结合配体时无活性,Ⅲ型受体是蛋白多糖,不直接参与信号转导,通过调节受体与配体结合的亲和力发挥作用。

2 TGF-β1/Smads信号转导通路的生物学特性

2.1 TGF-β1 生物学特性 TGF-β1在正常成人肝脏中主要由肝窦内皮细胞、Kupffer细胞、窦内皮细胞、淋巴细胞等细胞表达,HSC表达较少,但当肝损伤时HSC表达TGF-β1明显增多。TGF-β1在所有类型的细胞中均以无活性的形式合成与分泌,对多种细胞的增殖分化、组织损伤修复、胚胎发生、免疫抑制及肿瘤发生中起着重要作用。另外,它在细胞外基质的产生、修饰以及成分的变化、细胞黏附、细胞之间的相互作用中也发挥着重要作用,并可抑制肝细胞再生,诱导肝细胞凋亡。

2.2 TGF-β1/Smad信号转导过程 其过程一般包括胞外激活、信号跨膜、胞内信号传递三部分。首先是TGF-β1在基质金属蛋白酶(MMP)、纤溶酶等作用下被激活,激活后可与受体结合并表现生物活性,其次,TGF-β1与Ⅱ型受体胞外端结合,Ser/Thr激酶即被激活形成复合物,随后Ⅰ型受体以二聚体形式加入,Ⅰ型受体的GS结构域被Ⅱ型受体激酶磷酸化后激活并形成异源四聚体复合物,Ⅰ型受体活化是TGF-β1信号转导的起点,也是最关键的一步[4];活化的TGF-β1与细胞膜表面受体结合后,激活存在于胞内的Smad蛋白,活化的Ⅰ型受体分子使Smad2和Smad3分子磷酸化形成异质低聚物,再与Smad4分子结合,形成Smad异源多聚体而转位进入胞核,与靶细胞DNA上特定的Smad结合元件(Smad-binding elements,SBEs)序列CAGAC或AGAC结合,促进靶基因的转录。

2.3 Smad蛋白生物学特性 研究表明Smad蛋白是目前所知的唯一的Ⅰ型受体胞内激酶的底物[5],Smad蛋白介导TGF-β1胞内信号转导,是TGF-β1信号通路的关键转导分子,目前已知至少有8种Smad蛋白,按功能分为三类分别为:受体调节型Smad(R―Smad)蛋白,包括Smad1―3,Smad5,Smad8,共同通路型Smad(Co―Smad)蛋白,包括Smad4,Smad4蛋白并不是对所有的TGF-β信号通路都是必须的[6],抑制型Smad(I―Smad)蛋白,包括Smads6―7,Smad6能够抑制Smad异源多聚体形成和受体调节型Smad蛋白的磷酸化,Smad7是TGF-β1/Smads信号转导通路中重要的负性调节因子,对TGF-β1受体后信息调控表现为负性调节[7],Smad 7与R-Smad竞争激活的TGF-β1,并形成稳定的结合,干扰TGF-β1与Smad 2, 3的作用,阻止Smad 2, 3磷酸化, 抑制R-Smad与Co-Smad结合,继而阻断信号的后续转导以阻遏转录[8]。TGF-β1自身可强烈、迅速地诱导Smad7表达,Smad7的过度表达可抑制HSC转分化并将其阻止在静止阶段。W iercinska等[9]通过分析HSC中Smad7依赖的mRNA的表达谱,鉴定出分化抑制子 1( inhibitor of differentiation 1, Id1)基因。Smad7异常表达可明显减少Id1的表达;相反地, Id1在HSC中的高表达将促进细胞活化并且绕过Smad7依赖的转分化抑制。Id1作为HSC中TGF-β/激活素受体样激酶1(activin receptor-like kinase1,ALK1)/Smad1的目标基因,有可能是一个调控转分化的关键因子。

2.4 TGF-β1/Smad信号转导通路交互对话 近年发现,TGF-β1也可以通过p38MAPK、胞外信号调节激酶(ERK)、氨基端激酶(JNK)信号途径调节HSC的生物学行为[10]。Tsukada等 [11]发现,TGF-β1分别通过smad和p38MAPK独立的调控al Ⅰ型胶原基因的表达,但是二者的作用是可以叠加,进一步研究表明,TGF-β1是通过p38MAPK信号途径,而并非通过smad途径增加al ImRNA的稳定性,同时阻断这二条信号途径几乎完全抑制al I胶原基因的表达.

3 TGF―β1在肝纤维化中的作用

HSC在肝纤维化中的作用目前认为是肝纤维化形成的中心通路,活化的HSC是ECM的主要产生细胞,多种细胞因子参与了HSC的活化,而TGF-β1是其中最有效的刺激因子已经达成广泛共识。TGF-β1通过TGF-β1/Smad信号转导通路途径对在肝纤维化中的主要作用是促进HSC激活,并转化为肌成纤维样细胞,诱导活化的HSC收缩,在HSC活化早期刺激ECM的合成与沉积, TGF-β1水平异常增高是诱导肝纤维化发生发展的关键因素,TGF-β1可以调节HSC的基因表达类型和水平,以及参与肝纤维化有关的多种蛋白的表达。其致肝纤维化作用具体表现在:①促进HSC表型转化;②刺激HSC的ECM合成和分泌;③抑制ECM的降解。④上调HSC表达细胞因子及炎症介质,⑤TGF-β1自身形成TGF-β1的自分泌环路,从而促进静息HSC激活。随着HSC的激活,I型胶原增多,Ⅱ型减少,这种量的变化有利于产生ECM ,同时使TGF-β1的增殖作用增强,而抑制作用减弱。最近有学者经研究认为,在TGF-β1作用下,肝细胞本身也能呈间充质细胞形态改变,并合成Ⅰ型胶原,在肝纤维化的形成过程中肝细胞也可能起到一定的作用,但是其是否通过TGF-β1/Smad信号通路传导刺激信号还需要进一步研[12]。TGF-β1能通过覆盖TNF-α等胶原抑制因子,在胶原基因的反应元件上,上调促分裂细胞因子PDGF受体在HSC中的表达,间接促进纤维化。TGF-β1在体内外均能

抑制多种细胞生长,使这些细胞停滞于G1期并诱导凋亡,肝纤维化时TGF-β1诱导的凋亡主要发生在肝实质细胞,而它又能促进HSC的PDGF受体表达,间接促进HSC增殖[13]。

4 干扰TGF-β1―/Smads信号转导通路在抗肝纤维化中的作用

4.1 抑制TGF-β1合成 TGF-β1与HSC表面相应受体结合,促进肝纤维化的发生发展,它是现知作用最强的促肝纤维化因子。故可通过抑制其活化或受体后机制来阻断TGF-β1介导的信号传导途径而抗肝纤维化。抗纤维化TGF-β的拮抗剂包括:抗TGF-β抗体、TGF-β1反义寡核苷酸、可溶性Ⅱ型TGF-β1受体等。TGF-β1拮抗剂通过下调TIMP和增加MMP的活性具有抑制实验性肝纤维化的疤痕形成[14]。目前许多研究观察TGF-β1抗体或可溶性受体对肝纤维化的干预效果,在实验性研究中,通过减少TGF-β1合成,阻断其生物学信号,已被证明这些药物抗肝纤维化效果确切,但还需在临床研究中进一步验证其功效[15],例如,色氨酸蛋白酶抑制剂Camostatmesilate可抑制活性TGF-β1释放,对兔实验性肝纤维化有保护作用[16].

4.2 阻断细胞膜TGF-β1受体 膜受体在信号转导过程中将外源的信息传递到胞内,阻断了受体,也就阻断了信号通路,利用截短的TGF-β1 II型受体基因转染TGF-β1 II型受体细胞,使其缺少大部分的胞内段, 失去酶活性,不能活化TGF-β1 I型受体,从而阻断了TGF-β1信号在受体水平的转导。蒋就喜[17]等运用基因重组技术,构建大鼠缺陷型TGF-β1 II受体表达质粒载体,将其导入CCL4诱导的肝纤维化的大鼠体内,经酶切和DNA测序鉴定缺陷型TβRII受体真核表达质粒载体构建成功,经缺陷型TGF-β1 II表达质粒处理的大鼠肝纤维化程度轻,血清PCIII、IV-C、HA和LN均较未经处理组低,说明经缺陷型TβRII表达质粒处理后可减轻CCL4诱导的肝纤维化增生。Jiang[18]等利用反义TGF-β1 I型受体重组质粒使TGF-β1 I型受体基因下调,可预防猪血清诱导的大鼠肝纤维化的进展。

4.3 Smad信号调控 利用Smad6、Smad7具有负性调控作用,国外学者采用Smad6、Smad7 RNA的重组体导入HSC来对TGF-β1/Smad通路进行干扰.Dooley 等[19]等将携带有Smad7 cDNA的腺病毒颗粒通过尾静脉和门脉注射到大鼠模型中,结果发现大鼠肝脏星状细胞中Smad7表达量大大增加,而α-平滑肌肌动蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA)、肝脏内胶原的表达受到抑制.Inagaki etal设计了腺病毒重组体表达了绿色荧光蛋白和TGF-β1/Smad的信号抑制物,即YB-1(Y-box-binding protein),再将重组体注射到2组小鼠体内.结果表达的YB-1能显著减少胶原基因的启动子的活性,从而抑制了肝纤维化的进展[20].

4.4 中药干扰TGF-β1/Smad信号转导通路 近年来国内不少学者应用中药对此信号通路进行干预实验并取得了实质性进展.曾维政等[21]在运用中药红景天干预性治疗CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型的实验中发现:红景天甙干预性治疗组大鼠肝组织中TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表达明显下降,而Smad6、Smad7蛋白表达显著增加,从而抑制了TGF-β1介导的肝纤维化Smad信号传导通路. 毕青等[22]通过病理、免疫组化,发现抗纤软坚冲剂能明显抑制肝纤维化大鼠的HSC与TGF-β1及其受体,而发挥抗肝纤维化作用。其他国内学者在中药单体抗肝纤维化的分子机制研究中也把此信号通路作为重要的药物靶点.实验证明,姜黄、已酮可可碱、苦参素等均能够明显降低肝脏中减少TGF-β1的含量,抑制TGF-β1/Smad信号转导通路,从而延缓肝纤维化的进程.

5 问题与展望

在损伤因素的作用下HSC发生活化、增值、转型,分泌大量的TGF-β1,开启了TGF-β1/Smad信号转导通道,从而导致了大量胶原蛋白等细胞外基质的过表达,故TGF-β1/Smad信号通路在肝纤维化中具有重要意义,使用特异药物干预TGF-β1/Smad信号通路及抑制TGF-β1产生、促进其凋亡,为肝纤维化的防治提供新的思路. 然而在HSC中存在多条信号通路,TGF-β1/Smad信号转导通路与这些通道存在相互“交流”作用,对其实施精确定位阻断和阻断后HSC的生理、病理变化,还需要进一步的实验研究加以阐明. TGF-β1具有多种生物学功能, 在肝脏不仅对HSC有重要作用,还通过不同的信号通路参与众多的病理、生理过程.长期抑制TGF-β1的活性可能导致其他严重的问题,如免疫功能紊乱、甚至可诱导肿瘤发生,这些问题还有待作进一步的研究和评估。

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