对虾细胞永生性转化研究进展

摘 要：对虾细胞系是研究对虾病毒和发展病毒疫苗的有利工具和技术。但由于体外培养对虾细胞的有丝分裂相极低，难以脱分化，致使对虾的永生性细胞系一直未能成功建立。本文从物理、化学和生物学方面综述了对虾细胞的永生性转化研究概况，并展望了建立对虾永生性细胞系的研究前景。

关键词：对虾细胞 永生性转化 研究进展

中图分类号：R73 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）04（c）-0248-02

随着对虾人工养殖集约化的发展，对虾病毒病日益频繁爆发，对虾细胞系是分离和纯化对虾病毒、研究病毒的致病机理、发展有效的诊断试剂和防控技术以及生产高效的病毒疫苗等的有利工具和研究技术。为建立对虾细胞系，国内外专家学者进行了大量的探索和不懈的努力，对虾细胞难以脱分化和有丝分裂寿命短是对虾细胞一直未能成功建系的两个制约性问题。人们逐渐意识到，仅仅靠改进对虾细胞培养基和培养条件可能难以实现对虾细胞的永生性转化。因此随着分子生物学的发展，逐渐有人开始尝试采用物理、化学和生物学方法来诱导转化对虾的原代细胞，以期望获得永生化的对虾细胞系。

1 物理方法诱导对虾原代培养细胞永生性转化

X-射线、电离辐射和60Co射线处理可以诱导细胞遗传物质发生变异，从而干扰细胞的衰老机制，激活细胞永生性相关基因的表达，是哺乳动物细胞常用的行之有效的永生性转化物理诱导手段。1990年，Crane最早尝试采用γ射线、x-射线和电离辐射处理原代培养的对虾细胞以使之发生变异成为永生性的细胞系，但是没有成功。虽然失败了，但这是对虾细胞永生性转化道路上的一次很好的探索[1]。

2 化学方法诱导对虾原代培养细胞永生性转化

5-溴尿嘧啶（BU）、甲基磺酸乙酯（EMS）、和N-甲基-N′-亚硝基胍类化合物（MNNG）等化学诱变剂都可引起细胞癌变，发生永生性转化。2001年，郎刚华等应用MNNG对中国明对虾淋巴组织原代培养细胞进行多次化学诱变处理，虽然诱变后的细胞呈现多层生长，并出现由成纤维样变为上皮样等转化特征，但没有实现连续传代[2]。

3 生物学方法诱导对虾原代培养细胞永生性转化

3.1 生长因子

细胞生长因子具有刺激细胞生长和繁殖，抑制细胞分化的生物学特性。1995年，Hsu等首次采用碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）对斑节对虾的淋巴细胞进行诱导转化，发现经诱导处理后的淋巴细胞不需饲养层就可生长繁殖，并传代超过90代[3]。但随后该细胞系被证实为污染的单细胞真核生物（Thraustochytrids）。2002年，樊廷俊等在对虾细胞培养基中同时添加了bFGF和胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF-II）以诱导中国明对虾淋巴细胞转化，转化后的细胞在报道时已传代培养4代，但并未见到成功建系的后续报道。虽然已有不少研究发现在添加生长因子的情况下，对虾细胞的生存和增殖能力获得了不同程度的改善，但是目前还未发现哪一些生长因子能支持对虾细胞发生自发性转化并获得无限增殖能力。

3.2 细胞融合

通过细胞融合有可能获得具有两种亲本细胞生物学特性的杂交细胞。将已成系的永生性细胞与对虾细胞融合，有可能获得具有无限增殖能力的对虾细胞。2001年，樊廷俊和史振平将已成系的牙鲆鳃细胞（FG）与中国对虾淋巴组织原代培养细胞，通过聚乙二醇（PEG）诱导融合法进行杂交，筛选出可继代培养的杂交细胞，并将杂交细胞传代培养12次，但未见有该对虾杂交细胞成系的后续报道[4]。2010年，Claydon等同样采用PEG诱导融合法分别将鲤鱼上皮瘤细胞系（EPC）和草地夜蛾蛹卵巢细胞系（Sf9）与对虾血淋巴原代培养细胞进行融合，并成功筛选得到杂交细胞系，但是该细胞系缺乏甲壳纲动物细胞体外病毒复制的关键成分不能用于对虾病毒的研究，因而不能解决对虾细胞建系的根本目的。

3.3 病毒癌基因

猿猴病毒40（SV40）是简单的真核细胞病毒，SV40的大T抗原（SV40LT）可抑制肿瘤抑制因子p53蛋白的活性，因而将SV40LT基因导入哺乳动物细胞中，可成功诱导细胞的永生性转化[5]。1995年，Tapay等首次采用脂质体转染法成功将SV40LT基因转染到南美蓝对虾原代培养淋巴细胞中，发现转染后淋巴细胞呈圆形，聚集成葡萄样细胞团，贴壁不紧，生长速度加快，可传代18～44次以上；而未转染的淋巴原代细胞呈成纤维样，贴壁紧，不能传代。遗憾的是，最终也没有成功建立对虾淋巴细胞永生性的细胞系。2006年，胡国斌等利用复制缺陷型-泛嗜性逆转录病毒作为载体，也成功将SV40LT基因转染到中国对虾原代培养淋巴细胞中，转基因细胞呈现了转化特征，但传代细胞由于真菌污染未能保留下来。

人状多瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的E6和E7基因编码的E6和E7蛋白可分别与抑癌基因p53和Rb结合，从而影响细胞的增殖、转移和细胞周期，诱发细胞永生性转化。2008年，Claydon将HPV的E6和E7基因转染到红螯螯虾的原代培养细胞中，结果发现转染细胞可存活4个月，但存活的对虾细胞不分裂[6]。

4 前景展望

成功建立对虾连续性细胞系的关键问题之一是对虾培养细胞的永生性转化。哺乳动物细胞中端粒酶活性的有无决定了细胞寿命的长短。肿瘤细胞的端粒酶常常被激活而获得永生性。Lang等（2004）报道，对虾细胞中可检测到端粒酶活性，而且日本对虾淋巴组织原代培养细胞的端粒酶的活性可以维持30天[7]。但Jayesh（2012）在对虾原代培养细胞中却并未检测到端粒酶活性。因此，通过转染端粒酶基因是否能够提高体外培养对虾细胞的寿命，以获得永生性对虾细胞系尚有待进一步实验验证。

分子重编程技术是近年来发展起来的一种通过在细胞中过表达多能性因子来实现分化细胞向多能干细胞逆转的技术。2006年，山中伸弥领导的研究小组利用逆转录病毒基因转移技术，将4个多能性转录因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）共转染到小鼠成纤维细胞中，成功诱导成纤维细胞的去分化，并重编程为多能干细（即iPS细胞），而且所获得的iPS细胞有高达50%的动物致瘤性。因此，将分子重编程技术应用于对虾细胞，以实现对虾细胞的脱分化与永生性转化，不失为今后对虾细胞建系的一个新的研究方向和突破口。

对虾永生性细胞系的建立是一个不断探索的过程，可能需要漫长的时间。目前，尽管对虾细胞永生性转化未取得成功，但实验中的尝试和探索为最终实现体外培养对虾细胞的永生性转化奠定了基础，并为以后的研究和发展提供了经验和借鉴。

参考文献

[1] Crane，M St J.Mutagensis and cell transformation in cell culture[J].Methods in Cell Science，1999，21：245-253.

[2] 郎刚华，王勇，陈西广，等.中国对虾淋巴组织的长期原代培养和化学诱变初探[J].青岛海洋大学学报，2001，31（3）：411-414.

[3] Hsu Y-L，et al.Development of an in vitro subculture system for the oka organ（Lymphoid tissue）of Penaeus monodon[J].Aquaculture，1995，136： 43-55.

[4] 樊廷俊，史振平.牙鲆鳃细胞与中国对虾淋巴细胞杂交细胞的体外培养[J]. 水产学报，2001，25（1）：11-15.

[5] Berthon P，Goubin G，Dutrillaux B，et al.Single-step transformation of human breast epithelial cells by SV40 large T oncogene[J].Int J Cancer， 1992，52（1）：92-97.

[6] Claydon K，Owens L.Attempts at immortalization of crustacean primary cell cultures using human cancer genes[J].In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal，2008，44（10）：451-457.

[7] Lang G H，et al. Detection of telomerase activity in tissues and primary cultured lymphoid cells of Penaeus japonicas [J].Mar.Biotechnol，2004（6）：347-354.