灵杆菌素的分离纯化研究

【摘要】灵杆菌素是从粘质沙雷氏菌菌体中提取的生物药物，其主要成分是脂多糖，大量临床实验证明灵杆菌素是一种可诱导免疫抗体产生的超抗原，在预防和治疗某些疾病具有巨大的应用价值。然而目前关于灵杆菌素基础研究工作进行的还是比较少，其生产工艺和质量控制手段也比较陈旧，制约灵杆菌素的发展。其中如何进行高效率的纯化并尽可能的减少杂质的引入是首要问题。本实验采用科学筛选过的凝胶过滤层析法对灵杆菌素进行分离纯化，以提高药效组分的含量和质量，同时形成一套科学评价质量稳定性的检测体系，并确定本实验方法的可行性。

【关键词】灵杆菌素；脂多糖；分离；纯化；凝胶柱层析

1实验过程

1.1粘质沙雷氏菌的培养[1,2]

培养基的制备

基本固体培养基：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、氯化钠5 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g，蒸馏水1000 ml，pH 7.2~7.4。

液体发酵培养基：葡萄糖8 g、蛋白胨8 g、酵母膏6 g、牛肉膏1 g、氯化钠2 g、K2HPO4 4 g、KH2PO4 1.5 g，蒸馏水1000 ml，pH 7.4。

种子培养基配方为：牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、K2HPO4 2 g、氯化钠5 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1000 ml，pH 7.2-7.4。

菌种活化：将菌种稀释于100 ml蒸馏水中，在无菌条件下用接种环以划线形式接入预先倾注好并灭菌过的斜面培养基中，置于28 ℃电热恒温培养箱中培养12 h，观察斜面上有大量红色菌种生长为宜。将斜面置于冰箱中保存，备用。

菌种发酵：将所保存的粘质沙雷氏菌菌种30 ℃下活化8h后，在超净台中将斜面培养的菌株接入到装有200 ml 种子培养基的500 ml 三角瓶中，接种量4%，接种后于30 ℃，150 r/min，水浴恒温振荡器中培养72 h。

1.2灵杆菌素的提取[3-8]

1.2.1菌体粗品的制备

将水浴恒温振荡器中培养了72 h的菌种于离心机中3000-4000 r/min离心20 min。弃上清，将下层沉淀用蒸馏水洗脱，洗脱后再次离心，条件同上。再次离心后弃上清，将下层沉淀用三倍体积丙酮洗脱，并搅拌20 min左右，洗脱后再次离心，条件同上。弃上清，将下层沉淀倒入事先已称好重并标记好的干燥平皿中，于60 ℃烘箱中烘干即得灵杆菌素粗品，4 ℃冰箱中保存。

1.2.2灵杆菌素制备

本实验采用酚水法提取灵杆菌素。

1.2.2.1破壁 将灵杆菌素粗品于研钵中进行充分研磨，至粉末状即可。

1.2.2.2提取 将粗品粉末加入到60 ml事先配制好的45%的苯酚溶液（g：V）中，均匀混合，于水浴锅中70 ℃恒温搅拌30 min。

1.2.2.3离心 将上一步骤中的混合液浆冷却，3000-4000 r/min离心20 min，使酚相与水相分离，取上清。

1.2.2.4透析 离心后用2 ml注射器吸取水相上清液，然后将上清液装入透析袋中，透析除酚，透析时间为12 h。

1.2.2.5醇沉 透析时12h后进行醇沉，沉淀剂是95%的乙醇，加入5倍体积于多糖浓缩液的95%乙醇就可很好的沉淀多糖，醇沉时间12 h。

1.2.2.6冷冻干燥 醇沉12 h后离心弃清液，取沉淀加适量蒸馏水充分溶解，然后倒入已称重并记录的干燥平皿中，真空冷冻干燥12 h，得到白色絮状沉淀物，即为灵杆菌素粗提取物。

1.3 灵杆菌素的分离纯化[9,4,10]

采用醇沉或其它溶剂所获得的多糖，常混有较多的蛋白质，脱去蛋白质采用Sevag法：将氯仿按多糖水溶液1/5体积加入，然后加入氯仿体积1/5的丁醇，剧烈振摇20 min，离心，分去水层与溶液层交界处的变性蛋白质。此法较温和，但需要重复5次左右才能除去大部分蛋白质，后再进行真空干燥，即得到纯多糖粉状产品。

1.4凝胶过滤层析

1.4.1凝胶选取及参数设定[8,11-14]

本实验选取2 cm×50 cm层析柱，葡聚糖Sephadex G-150凝胶，去离子水洗脱。

1.4.2凝胶过滤

葡聚糖凝胶G-150的预处理：称取4.500 g 葡聚糖凝胶G-150加入250 mL去离子水，逐渐加热至煮沸5 h，冷却备用，或常温静置72 h。

装柱：将层析柱垂直放置，倒入适量的洗脱液（去离子水），将与处理好并用倾注法除去小颗粒的凝胶悬浊液缓慢倾入柱中，待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端出口，让溶液慢慢流出，保持吸附剂表面平整并一直浸没在溶剂中，防止产生气泡，用洗脱液平衡24 h。

上样：1 mg/ml神灵杆菌脂多糖样品溶液（已脱蛋白，去离子水配制）上样3 ml，并同时从柱底放出3 ml平衡水，使样品完全进入凝胶内部。

洗脱收集：去离子水为洗脱液，上样60 min后开始洗脱收集馏分，流速为0.25 ml/min，20 min/管，共20管。用苯酚-硫酸法检测各管的吸光值OD490。

1.5苯酚-硫酸法检测结果

表 各管馏分用苯酚-硫酸法于490nm处测吸光值(A)

管 1 2 3 4 5 6 7

OD490 0.025 0.031 0.030 0.325 0.492 0.404 0.380

管 8 9 10 11 12 13 14

OD490 0.356 0.315 0.277 0.284 0.244 0.219 0.207

管 15 16 17 18 19 20 --

OD490 0.112 0.115 0.114 0.102 0.169 0.132 --

从上述表格中各管馏分490nm处OD值看出，第5管有最大吸光值，故此管中含糖量最大。

2本课题的研究结论

灵杆菌素已被广泛证实是最具潜力的免疫增强剂，临床药理学研究显示灵杆菌素的研究将具有很大的价值，但目前国内外对于灵杆菌素的纯化工艺优化探讨和研究方面所做的工作较少。

通过对粘质沙雷氏菌的发酵，再经酚水法制备出灵杆菌素的粗品，然后通过Sevag法除蛋白，用凝胶过滤层析技术来对其分离纯化。采用葡聚糖凝胶G-150作为介质，1 mg/ml灵杆菌素样品上样3 ml，流速0.25 ml/min，去离子水洗脱，20 min/管，共收集20管，并用苯酚硫酸法490 nm处测OD值。从结果可知，从第4管开始含糖量增加，第5管有最大吸光值，即含糖量最高，后含糖量逐渐降低，初步达到了分离纯化灵杆菌素脂多糖的效果。结果证明本实验方法是可以实施，从而也为今后的纯化工艺优化工作奠定了基础。

参考文献

[1] 郝林华,陈靠山,牛德庆等.粘质沙雷氏菌（Serrtia marcescens）发酵培养基优化的研究[J].海洋科学进展.2006,1(24):67-73.