韭菜单倍体培养技术研究

摘要 为了改变传统育种方式，采用组培方式培育新品种，是近年来采用的新育种手段。韭菜单倍体培养采用以花药为培养材料，选择合适的培养基以及冷处理、暗培养、适宜的温度、湿度、光照，培育出健壮的瓶苗，继而移入大田，进行继代繁殖，从中选育出优良品种。试验结果表明，可通过花药培养成功诱导出花粉植株。

关键词 韭菜；组培；单倍体；培养基

中图分类号 S633.3 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）09-0067-01

韭菜是百合科多年生草本生植物，适应性强，性喜冷凉，抗旱耐热，全国各地到处都有栽培。原产亚洲东南部，中国韭菜品种资源十分丰富。韭菜无论从营养价值还是药用价值，都具有很好的市场。因此，对我国韭菜品种进行组织培养研究，对于提高韭菜的品质与产量具有很重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试韭菜选自大田，选取健壮、无病虫害的植株。仪器包括75%酒精、0.1%升汞、洗洁精、灭菌三角瓶、无菌水、解剖刀、无菌培养皿、镊子、剪刀、超净工作台。

采摘8月成熟花朵，用醋酸洋红染色压片观察花粉母细胞、四分体时期、单核早中期、单核靠边期、双核期。其中单核靠边期是组织培养中诱导单倍体植株的最佳接种时期。

1.2 培养基配制

增殖培养基：Ms大量+Ms微量+CaCl2+铁盐+Ms有机+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+琼脂粉5.5 g/L+香蕉泥100 g/L+蔗糖20 g/L（pH值5.6～5.8，下同）（A）；Ms大量+Ms微量+CaCl2+铁盐+Ms有机+6-BA 5.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+柠檬酸60 mg/L+琼脂粉5.6 g/L+香蕉泥100 g/L+蔗糖20 g/L（B）。生根培养基：1/2Ms大量+Ms微量+CaCl2+铁盐+Ms有机+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+柠檬酸+（GA3+VW+VH）+琼脂粉6.5 g/L+蔗糖20 g/L（C）；Ms大量+Ms微量+CaCl2+铁盐+Ms有机+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+柠檬酸+（GA3+VW+VH）+琼脂粉5.5 g/L+蔗糖20 g/L（D）。

1.3 试验实施

1.3.1 材料消毒。用洗衣粉清洗试验材料，用水冲洗4～5遍，然后放在操净工作台上，再用0.1%升汞浸泡10 min，酒精浸泡30 s，再用无菌水冲洗5遍，放入三角瓶中。

1.3.2 接种。取一花蕾，将花序的苞叶除去，取出内部的花序，用消过毒的镊子和刀片，切去花序的底端1/4，将其接种在不同浓度的培养基上，放入培养皿中，一皿放入50粒左右。

1.3.3 花药培养条件。一般是光照和黑暗周期交替进行。把培养皿分成2个部分，进行冷处理和暗培养，分别为24 h和48 h，然后放在铁架台上，用日光灯进行光照培养。光照强度2 000～3 000 lx，光照时间12 h/d，温度20～25 ℃。

1.3.4 增殖培养。培养5 h后，花药逐渐变为黑褐色，20 h左右花药裂开，并在培养基上长出淡黄色的花粉愈伤组织，30 h以后，愈伤组织会变成黄色的瘤状物体，其顶端有小绿点出现，这些绿点在3～5 h后形成芽。愈伤组织在增殖培养基上继续分化，长出1 cm长绿芽时进行第2次转接，转入10 cm宽、20 cm高的培养瓶中，长出花苗，在生根培养基上继续分化，形成根。7 d观察1次，记录花药萌况。

1.3.5 继代繁殖。长成丛生苗后，从培养瓶中取出，放入培养皿中，用剪刀除去丛生苗顶端，剩3～4 cm长丛生苗。继续在适当培养基上培养，观察记载生长情况。

1.3.6 大田栽植。出瓶前进行炼苗，揭去培养瓶上的封口膜，在20 ℃左右的温室中炼苗，7 d后移入盛有基质的营养钵中，室内培养6个月，第2年3月定植在大田，6月进行田间调查，10月底采收。种在大田后，浇水施肥，进行调查研究。测量苗高、叶宽、叶色等，与传统定植韭菜进行比较，观察抗病性、抗逆性、病虫害防治等。灌溉施肥除草，8月成熟以后，不同品种之间进行自交授粉，最后采收种子，以及测定产量，进行区域试验。计算千粒重，保存资源。

2 结果与分析

试验结果表明，可通过花药培养成功诱导出花粉植株，由此说明可通过诱导雄核发育（花药和小孢子培养）获得单倍体是韭菜单倍体育种的一条途径。

常用于组织培养的植物激素有生长素类与细胞分裂素类两大类[1]。生长素类的主要作用是重新启动有丝分裂，使已停止分裂的植物细胞恢复分裂能力[2]。常用生长素有IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丙酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）、NAA（萘乙酸），对多数植物材料的培养而言，2，4-D和NAA是生长素中诱导愈伤组织最有效的物质，常用浓度为0.2～3.0 mg/L，愈伤组织诱导的培养基中，高浓度的生长素类结合低浓度的细胞分裂素类对提供胚性愈伤组织的发生是需要的。细胞分裂素的主要作用是促进细胞的分裂与扩大，诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长[3]，常用的细胞分裂素有6-苄基腺嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）等。细胞分裂素在诱导愈伤组织时，一般要与生长素配合使用，增强生长素的诱导作用和效果，当诱导出胚性愈伤组织以后，进行其增殖（继代）、分化再生植株时，细胞分裂素起到重要作用。根据实际需要选用适当的细胞分裂素种类[4]。

3 结论与讨论

单倍体育种可快速获得纯合自交系，缩短育种年限，具有重要的的研究价值。试验结果表明，韭菜品种可通过花药培养成功诱导出花粉植株，说明通过诱导雄核发育（花药和小孢子培养）获得单倍体是韭菜单倍体的一条途径[5-8]。

4 参考文献

[1] 李胜，李唯.植物组织培养原理与技术[M].北京：化学工业出版社，2007.

[2] 李俊明.植物组织培养教程[M].北京：中国农业大学出版社，2008.

[3] 沈国林，邵爱娟，黄璐琦.三叶木通愈伤组织培养研究[J].中国中药杂志，2007，32（10）：899-901.

[4] 杜希华，孙秀玲，郝岗平.不同外植体和激素对白菜愈伤组织诱导和生长的影响[J].山东师范大学学报，2008，23（1）：129-133.

[5] 翟丽华.植物生长调节物质对组织培养中不定芽不定根的作用[J].辽宁师专学报（自然科学报），2008，2（2）：97-99.

[6] 高行英，李梅兰，王婷婷，等.不同抗生素对韭菜根愈伤组织诱导及再生的影响[J].分子植物育种，2013，11（4）：559-565.

[7] 屈二军，张现青，赵桢，等.韭菜愈伤组织诱导条件优化的研究[J].种子世界，2008（6）：24-25.

[8] 屈二军，张现青，赵桢，等.植物激素对韭菜愈伤组织诱导的影响[J].安徽农业科学，2008，36（18）：7574.