时间：2022-10-04 09:00:40
分子遗传差异(differentiationatneutralmolecularmarkers,FST)是传统的衡量种群遗传分化、种群遗传结构的基本指标(Weir&Cockerham,1984;Wright,1965),在遗传学领域有着广泛的应用。数量性状差异(differentiationinquantitativetraits,QST)是指在遗传漂变、选择、基因流和环境适应性等因素作用下,群体间数量性状的差异(Lande,1992;Spitze,1993Wright,1951)。它是度量不同群体间数量性状差异程度的一个指标(Spitze,1993)。当QST显著大于FST时,表明群体受到了明显的选择压力;当QST显著小于FST时,表明群体处于稳定的平衡选择之中(O’Hara&Meril?,2005;Spitze,1993;Whitlock,2008)。基于上述假设,QST与FST的比较研究已成为近年来生物进化领域的研究热点之一(Edelaa&Bjrklund2011;Evannoetal,2006;Santure&Wang,2009Whitlock&Guillaume,2009)。水产生物自2007年报道了第一例QST与FST的比较研究(McClelland&Naish,2007)后,至今未见后续报道。由于QST的计算需根据群体的遗传方差,这对野生群体较为困难。目前大量研究均以表型性状差异(differentiationinphenotypictraits,PST)来代替QST(Brommer,2011Leinonenetal,2006;Raeymaekersetal,2007)。绒螯蟹是东亚地区的特有蟹类,中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)和日本绒螯蟹(Eriocheirjaponica是绒螯蟹属的两个最重要经济种类(Zhaoetal1988)。此外,分布于我国南方(如广西合浦、广东珠江等)的绒螯蟹为合浦绒螯蟹(Guoetal,1997;Ngeal,1999;Wangetal,2008)。有关作者利用线粒体部分序列分析发现：闽江是中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹的混杂地域(Wangetal,2008)。在生物学特性上,绒螯蟹的生命周期为两年,一生只繁殖一次,繁殖后亲本即死亡,奇年与偶年生绒螯蟹通常不发生遗传或基因交流(如2009年出生的绒螯蟹于2011年繁育,2010年出生的绒螯蟹于2012年繁育。2009与2010年和2011与2012年绒螯蟹不存在遗传基因交流),因而,闽江水系绒螯蟹为研究绒螯蟹的表型性状差异与分子遗传差异提供了良好的模型和材料。本文通过对2009年(奇年)与2010年(偶年)连续两年闽江水系绒螯蟹样本的表型性状差异和微卫星分子遗传差异分析,在国内外首次探讨水产生物的表型性状差异(PST)与分子遗传差异(FST)的关系,以期为绒螯蟹的分子进化研究积累资料,也为其它水产生物的类似研究提供参考或借鉴。
1材料和方法
1.1材料本文以2009和2010年10月上旬采集的闽江水系二龄绒螯蟹天然群体为材料。采样地点为闽江福州江段,2009年样本40只,2010年样本93只。
1.2形态数据测量首先对采集的每只绒螯蟹样本进行表型性状参数测定(图1),包括：体重(BW)、内额齿间距(A1)、外额齿间距(A2)、第一侧齿间距(A3)、第二侧齿间距(A4)、第三侧齿间距(A5)、第四侧齿间距(A6)、背甲后缘长度(A7)、背甲长(L)、体高(H)、第二步足长节长(F1)、第二步足掌节长(F2)、第二步足指节长(F3)、第二步足指节近掌节端宽度(F4)。体重精确到0.1g,其他性状精确到0.1mm。测量后样本取步足肌肉于95%的酒精中保存,用于DNA提取。
1.3DNA提取总DNA提取采用饱和氯化钠法：取绒螯蟹肌肉约0.1g,用镊子小心放入1.5mL离心管中,37℃烘箱中烘干酒精,加入STE裂解缓冲液(30mmol/LTris-HCl,200mmol/LEDTA,50mmol/LNaCl,pH8.0)420μL,10%SDS80μL,蛋白酶K(20mg/mL)20μL,混匀后放入56℃恒温箱中消化过夜;待消化完毕,加饱和NaCl溶液340μL,轻摇5min,然后加入氯仿340μL,轻轻混匀。室温条件下,13000r/min离心20min,取上清液转入另一干净的离心管中,加预冷(?20℃)的异丙醇400μL混匀,4℃,12000r/min离心20min,小心倒尽上清液,加入预冷(?20℃)的75%乙醇800μL洗涤DNA,混匀,4℃下12000r/min离心20min,倒掉乙醇,烘干。加入TE100μL溶解DNA,然后保存备用。
1.4微卫星标记的PCR扩增与检测应用已报道的六对绒螯蟹微卫星引物(Chengetal,2009)对样本进行PCR扩增。PCR反应总体积为10μL,包括1μL基因组DNA(20ng/μL)、5μL缓冲液(0.2μmol/LdNTPs,1.5μmol/LMgCl2,0.5μmol/LTaqDNA聚合酶)、1μL引物、3μL蒸馏水。PCR扩增程序：94℃预变性5min,随后进行35个循环,每循环为94℃变性30s、48～61℃退火3s、72℃延伸30s,最后72℃延伸10min。PCR产物利用德国Qiagen公司生产的遗传分析系统(QIAxcel)进行检测和片段分析。
1.5数据处理
1.5.1表型性状差异(PST)计算首先将表型性状参数分别除以背甲长(L),转换为比例性状参数,以消除规格大小对数据分析的影响,体重性状进行自然对数转换。然后,对转换后的数据进行正态性检验和均质性检验。应用Statistica8.0软件对校正后的数据进行单因素方差分析(ANOVA),以及计算各表型性状的群体内方差(2GWσ)和群体间方差(2GBσ根据Raeymaekersetal(2007)的公式计算表型性状差异(PST),公式具体如下：PST=222/(2)GBGBGWσσ+σ
1.5.2分子遗传差异(FST)计算根据微卫星标记的等位基因频率,利用FSTAT2.9.4软件(Goudeteal,1995)计算群体观测杂合度(HO)和期望杂合度(HE)、等位基因丰富度(AR)和近交系数(FIS),并进行哈迪?温伯格平衡检验(HWE)。应用Arlequin软件(Excoffier&Lischer,2010)计算群体间的分子遗传差异(FST)。
2结果
2.1表型性状差异对2009和2010年绒螯蟹样本的表型性状数据作正态性检验和均质性检验发现,所有表型性状参数均满足正态性分布(P=0.073～0.824)。2009年绒螯蟹的体重变异程度大于2010年绒螯蟹,而形态性状(F4除外)的变异程度略低于2010年绒螯蟹,具体如图2所示。单因素方差分析(ANOVA)表明：除A1(P=0.149)、F1(P=0.096)和F2(P=0.897)三个性状差异不显著外,其他各表型性状在不同年份间均存在极显著差异(P<0.149)(表1)。
2.2微卫星遗传变异2009和2010年度闽江水系绒螯蟹的微卫星遗传变异情况如表2所示。2009年绒螯蟹的平均等位基因数低于2010年绒螯蟹,而其观测杂合度、期望杂合度和近交系数均高于2010年。哈迪?温伯格平衡检验表明,除2010年群体中HPX-69位点符合哈迪?温伯格平衡外,2009年6个位点和2010年5个位点均偏离哈迪?温伯格平衡。经检验,年度间的期望杂合度存在极显著差异(P=0.008),而其他3个遗传变异指标均不存在显著差异(P=0.136～0.675)。两群体间的分子遗传差异(FST)为0.0165～0.4695,平均为0.1429。AMOVA分析(表3)也表明,两群体间的遗传变异，占总变异的14.29%,群体内个体间的遗传差异为21.54%。2.3PST与FST比较计算得出各性状的PST(BW:0.9788;A1:0.5105;A2:0.9266;A3:0.9525;A4:0.9317;A5:0.9028;A6:0.8306;A7:0.8895;H:0.9429;F1:0.5815;F2:0.0084;F3:0.9253;F4:0.9783)后,通过与FST的比较作图(图3)可以看出,除第二步足掌节长度(F2)这一性状外,其他性状的PST值均高于FST平均值。
3讨论
生物表型性状的数值比较宏观,相对容易获得，因此,通过研究生物的表型性状来发现生物个体以及群体间的差异是比较常用的方法(Leeann,2008;Myersetal,2001;Traka-Mavrona,1996)。本研究发现,在奇年(2009)与偶年(2010)闽江水系绒螯蟹的13个所测表型性状中,除三个性状(A1、F1和F2)不存在显著差异外,其他各性状均存在极显著差异，因为河蟹是一种生命周期为两年、一生只繁殖一次的生物(即2009年样本与2010年样本不存在交叉繁殖和基因交流),不同遗传背景和年份间生活环境会对表型性状造成较大影响,应用不同年份间的绒螯蟹样本探讨表型性状差异是可行的。微卫星标记常用于水产动物的研究中(Maetal,2005;Zhangetal,2010)。本研究通过微卫星标记分析发现,2009与2010年样本间，只在期望杂合度存在显著差异,而在等位基因丰富度、观察杂合度和近交系数这三个遗传参数均不存在显著差异,表明年份间样本的分子遗传变异与表型变异存在变异的非一致性,这为研究PST与FST提供了有利条件。以上也说明,闽江水系绒螯蟹可较好地应用于绒螯蟹的PST与FST研究。PST是度量不同群体间表型性状分化的程度,FST是度量不同群体间分子标记的遗传差异程度(Volisetal,2005;Yangetal,2008)。通过对PST和FST的比较,可了解不同进化机制对群体间差异的影响程度和作用大小。在迁移、突变或遗传漂变的作用下,群体间的表型性状差异近似于中性分子遗传差异,但多样性的选择会导致群体间的表型性状差异显著大于分子遗传差异(Lande,1992;McKay&Latta,2002;Meril?&Crnokrak,2001)。本研究通过对各性状的PST值计算,并与FST值进行比较,结果表明：除第二步足掌节长度(F2)外,其他各性状PST值都远大于FST值,这说明闽江绒螯蟹群体除F2外,其它性状均受到外界的选择压力,受到自然选择的作用,以及群体的地方适应性。