保肝颗粒抗大鼠肝纤维化的实验研究

摘 要：目的：探讨保肝颗粒对四氯化碳（CCl4）诱导的实验性肝纤维化大鼠纤维化水平的影响。方法：大鼠实质损伤性纤维化模型由CCl4诱导。60只雄性Wister大鼠被随机平均分为6组：正常对照组、模型组、保肝颗粒高、中、低剂量组及马替洛酯组。除正常对照组外所有大鼠均给予皮下注射40％CCl4(每3天1次，共11周)。造模3周后同时分别给予保肝颗粒18、9.0、4.5g/(kg•d)及马洛替酯90mg/(kg•d)，正常对照组给予等量生理盐水，每天1次，共8周。实验结束时检测肝功能、血清血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)和肝脏羟脯氨酸(HYP)，采用光镜观察病理组织学改变。结果：保肝颗粒能改善肝纤维化大鼠的肝功能，高、中剂量可显著降低血清HA、LN、PCⅢ水平和肝组织中过高的HYP；病理组织学检查亦表明其能显著改善肝纤维化程度。结论：保肝颗粒对CCL4诱导的大鼠肝纤维化有良好的防治作用。

关键词：保肝颗粒；肝纤维化；大鼠

中图分类号：R-33

文献标识码：A文章编号：

1673-7717（2008）11-2502-03

Experimental Studies of Baogan Granula on Anti-hepatic Fibrosis in Rats

HE Wei-he1，LIU Yong2,YANG Yan-tao1，TAN Feng1

（1.Hunan University of TCM，Changsha 410007，Hunan,China；

2.Hunan Normal University，Changsha 410081，Hunan,China）

Abstract：Objective:To investigate the effects of Baogan granula on fibrosis level of experimental liver fibrosis in rats．Methodes:60 male Wister rats were separated into six groups：control，model，Baogan granula high,median,low dose groups and malotilate group．All rats except those in the control group were given subcutaneous injection of 40% carbon tetrachloride(once every 3 days for 11 weeks).3 weeks later,rats in the treatment group were also given Baogan granula at 18,9.0,4.5g/(kg•d) daily for 8 weeks via gastrogavage．At the end of the treatment,the levels of hyaluronic acid(HA),laminin(LN)，precollagen III(PCIII) in serum and HYP in liver tissue were detected，the pathohistological changes were observed under light microscope．Results:Compared with model group，Baogan granula could protect hepatic function，especially the middle and high doses，could significantly degrade the serum levels of HA，LN，PCIII and the exorbitant HYP in liver tissue；Histopathologic examination also showed its significant amelioration effect on experimental liver fibrosis．Conclusion:Baogan granula Can greatly protect from liver fibrosis in rats induced by CCl4．

Key words：Baogan granula；hepatic fibrosis；rat

保肝颗粒是根据中医药理论及多年临床经验总结而成的中药复方制剂，由黄芪、丹参、大黄、五味子、鳖甲、首乌、桃仁组成，具有舒肝健脾、清热散瘀、保肝护肝、软坚散结之效。本研究旨在探讨保肝颗粒对大鼠实验性肝纤维化的疗效，笔者进行了部分实验研究，现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1药物及试剂

保肝颗粒由由北京中医药大学东方医院提供；四氯化碳购自北京化学试剂公司；马洛替酯(锦州制药一厂)；血清层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、IV型胶原(IV-C)、透明质酸(HA)、羟脯氨酸(HYP)、谷丙氨酸转移酶(ALT)、谷草氨酸转移酶(AST)试剂盒，均为南京建成生物工程研究所产品。

1.1.2动物清洁级Wistar雄性大鼠60只，体质量210~230g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：023号。

1.1.3仪器XTT实体显微镜（北京电光科学仪器厂）；722型分光光度计(北京西城医疗器械厂)；400R低温离心机(上海第三分析仪器厂)。

1．2方法

1.2.1 模型制作参照文献[1]方法：实验第1天除正常对照组外，其余动物皮下注射CCl4分析纯0.5mL/100g(体质量)，以后每3天注射40％CCl4橄榄油剂0.3mL/100g(体质量)，连续11周。实验前2周饲喂高脂玉米粉饲料(79.5％玉米粉+20％猪油+0.5％胆固醇)，第3~6周饲喂100％玉米粉和30％乙醇饮料。

1.2.2 分组及给药方法将60只大鼠随机分为6组，即正常对照组，模型组，马替洛酯阳性对照组及保肝颗粒高、中、低3个剂量组，每组10只。造模3周后，治疗组分别给予18、9.0、4.5g/(kg•d)保肝颗粒药液，以10mL/kg灌胃，每天1次，连续给药8周。阳性对照组每天灌胃马洛替酯90mg/kg(有关剂量的设置，马洛替酯系根据临床人用剂量换算)，空白对照组每天灌胃等量的生理盐水。

1.2.3标本取材及预处理各组动物在造模或给药后，称量体质量，以10%水合氯醛麻醉(0.35g/kg，腹腔注射)后，颈总动脉取血6mL，3000r/min4℃离心10min后，取上清液，-20℃保存待检。取肝脏，切取左侧肝脏组织约5mm×5mm×3mm大小投入10%福尔马林固定液中，取经固定的肝组织，经各级酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，4μm原切片，分别作HE、Masson三色染色，用于病理形态学观察。

1.3观察指标

1.3.1肝纤维化指标用放射免疫法分别测定血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)与III型前胶原(PCⅢ)的含量，均按试剂盒说明书操作。肝组织中HYP的检测按文献[2]的方法进行。

1.3.2肝功能用自动生化分析仪检测血清谷丙氨酸转移酶(ALT)、谷草氨酸转移酶(AST)和白蛋白(ALB)。

1.3.3 病理检测组织切片，分别行常规HE染色，Masson三色染色(染胶原纤维)及网织纤维染色，光镜下观察，观察肝脏组织病理形态学特征。

1．4统计学分析

计量资料用（±s）表示，采用SPSS11.0统计学软件，多组均数比较采用方差分析，组间均数比较采用q检验。

2结果

2.1 保肝颗粒对肝纤维化大鼠血清肝纤维化指标及肝组织HYP的影响

由表1结果可知，模型组大鼠血清中肝纤维化各项指标及肝组织HYP水平明显高于正常对照组(P

2.2 保肝颗粒对肝纤维化大鼠肝功能指标的影响

由表2结果可见，模型组大鼠血清中ALT、AST水平较正常对照组明显升高，而ALB水平明显降低(P

2.3肝脏组织病理学检查结果

正常对照组肝细胞未见变性与坏死，肝内未见纤维组织增生，汇管区不扩大，小叶结构清淅，肝组织正常。模型组HE染色可见肝小叶正常结构消失，增生的胶原纤维条索相互连接，完全分隔正常的肝小叶形成肝硬化，此时，形成了许多类圆形的肝细胞团为假小叶；其肝细胞索排列紊乱而不呈放射状，中央静脉异位(偏位、不出现或出现几个)，肝细胞团内出现门管区结构；假小叶内的肝细胞出现大量的颗粒样变性、胞质疏松化和细胞水肿，部分肝细胞可区分为脂肪空泡，散在灶性肝细胞溶解坏死，仍有被胶原纤维间隔再分隔的趋势；可出现毛细胆管内癖胆及胆栓形成。保肝颗粒高剂量组和马洛替酯组病变特征与模型组相似，但炎性细胞浸润明显减少，肝细胞坏死及脂肪变性较轻；纤维增生减轻且不均一致；胆管增生不明显，Masson三色染色显示纤维增生受到明显抑制，肝小叶中央静脉周围呈现不明显的纤维化，中央静脉管壁也可见不同程度的增厚，插入肝实质内的增生纤维组织明显减少。保肝颗粒中、低剂量组肝细胞病理变化与模型组比较差异不显著。

3讨论

肝纤维化指肝内细胞、纤维及基质的异常增生。主要成分包括胶原纤维、弹性纤维及基质成分氨基多糖。但以胶原纤维增生更为突出[3]。多是持续性肝损伤或存在促纤维化刺激因子的结果。近期研究显示，早期作出诊断并加以干预，针对原发病的病因治疗和抗肝纤维化本身的治疗，可以阻止甚至逆转肝纤维化[4]。因此，阻止肝纤维化形成，对防治肝硬化具有重要意义。

保肝颗粒是由黄芪、丹参、大黄、五味子、鳖甲、首乌、桃仁组成。近年的研究发现其中丹参的多种有效成分，如丹酚酸、丹参酮；黄芪的多种化学成分；大黄与首乌的有效成分，如大黄素、大黄酸等都具有较好的抗肝纤维化作用。保肝颗粒中多种有效成分抗肝纤维化作用环节不同，联合使用效果好于复方中任一组分的单用[5]，方中鳖甲入肝，软肝散结，祛邪养阴为君药；黄芪补人体之正气，丹参、桃仁活血化癖，同时辅以祛癖能力较强的大黄；佐药首乌养血益肝，五味子益气养阴。血清中HA、LN 、PCⅢ及肝组织中的HYP常用于肝纤维化的诊断，其水平的高低可作为慢性肝组织炎症坏死、纤维化程度和肝纤维化、肝硬化诊断的重要指标[6]。本实验结果显示，CCl4诱导的慢性肝纤维化大鼠有明显的肝损伤及慢性肝纤维化表现。给予保肝颗粒治疗后，肝功能指标明显改善，ALT、AST降低，ALB升高；高、中剂量还能使升高的HA、LN、PCⅢ及肝组织中HYP水平显著降低，且病理观察提示高剂量软肝颗粒可以明显地抑制模型大鼠肝组织胶原纤维的增生，肝板排列由无序变得有序起来，这样有利于肝细胞与肝窦之间进行有效的物质交换，从而减轻肝细胞损伤，提示保肝颗粒对CCl4诱导的大鼠肝纤维化有良好的防治作用。

参考文献

［1］ 郭美资,李孝生.大黄酸对大鼠肝纤维化形成的影响［J］.中华肝脏病杂志,2003(1):26.

［2］ 许志勤,高兴兰.组织羟脯氨酸测定方法的改进[J].预防医学杂,1990,8(1):40.

［3］ 程慧桢.安络化纤丸治疗慢性乙型肝炎、肝纤维化86例体会[J].山东医药,2004，44(26):67．

［4］ 王吉耀.抗肝纤维化治疗的途径[J].中国中西医结合杂志,2002,5(22):330.

［5］ 宋少刚,杨雁,陈敏珠.黄芪总提物对大鼠肝星状细胞增殖及产生胶原的影响[J].中国临床药理学与治疗学,2001,6(2):111-113.

［6］ 李亮,缪英年,月辰,等.平肝汤抗大鼠肝纤维化的实验研究[J].中国中医药信息杂志,2005,12(4):27-29.