1在造血干/祖细胞连续移植中对抗细胞衰老的作用研究'> 人参皂苷Rg1在造血干/祖细胞连续移植中对抗细胞衰老的作用研究

摘要 目的：探讨人参皂苷Rg1在造血干/祖细胞（HSC/HPC）连续移植中对抗细胞衰老的作用。方法：免疫磁性分选法分离纯化的雄性供体小鼠Sca-1+HSC/HPC连续移植3代构建HSC/HPC衰老体内模型。60Co γ射线致死剂量辐射雌性受体鼠后分4组：对照组、衰老模型组、Rg1治疗衰老组、Rg1延缓衰老组。荧光定量PCR检测受体鼠骨髓细胞Y染色体（Sry基因）表达，确定受体鼠重建造血细胞来源；观察受体鼠存活时间及外周血血象指标的恢复，确定受体鼠造血功能重建情况及Rg1促进造血恢复情况；造血祖细胞混合性集落（CFU-Mix）培养，细胞周期分析和衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色分析Sca-1+HSC/HPC衰老的生物学特点及Rg1体内调控Sca-1+HSC/HPC衰老的作用。结果：雌性受体鼠重建造血细胞来源于雄性供体鼠；连续移植后受体鼠30 d存活率明显降低，外周血象恢复延缓，Sca-1+HSC/HPC出现细胞衰老特征：G0/G1期细胞比例及SA-β-Gal染色阳性率增高，CFU-Mix数量下降。与同代衰老模型组相比，Rg1治疗衰老组及Rg1延缓衰老组受体鼠30 d存活率，WBC，HCT，PLT增高，Sca-1+HSC/HPC G0/G1期细胞比例、SA-β-Gal染色阳性率下降，CFU-Mix数量升高。Rg1延缓衰老组变化较Rg1治疗衰老组明显。结论：人参皂苷Rg1在HSC/HPC连续移植过程中具有延缓和治疗Sca-1+HSC/HPC衰老的作用。Rg1延缓衰老作用优于Rg1治疗衰老作用。

关键词 人参皂苷Rg1；造血干/祖细胞；抗衰老；连续移植

收稿日期 2012-12-25

基金项目 国家自然科学基金项目（30973818，81202785，30970872）；重庆市科委自然科学基金重点项目（CSTC，2009BA5038）

通信作者 *王亚平，教授，博士生导师，Tel：（023）68485968，E-mail：

作者简介 周玥，副教授，E-mail： 人参具有抗衰老、抗氧化、促进细胞增殖与分化等功能，人参皂苷单体Rg1（ginsenoside Rg1）是其抗衰老的有效药理成分[1-3]。本研究运用Sca-1+HSC/HPC连续移植实验构建Sca-1+HSC/HPC衰老体内模型，将Rg1作用于该模型，研究Rg1是否具有抗Sca-1+HSC/HPC衰老的作用。结果表明Rg1能增强Sca-1+ HSC/HPC自我更新及多向分化潜能，Rg1在体内具有较好的抗Sca-1+ HSC/HPC衰老的作用，其调控机制有待进一步深入研究。

1 材料

1.1 动物 清洁级C57BL/6小鼠，6～8周龄，雌雄均有，体重20～25 g，由重庆市医学实验动物中心提供，动物合格证号SCXK（渝）2007-0001。

1.2 试剂 人参皂苷单体Rg1（吉林宏久生物科技有限公司，纯度>95%）；IMDM、胎牛血清、马血清（Gibco公司）；Anti- Sca-1+ Micro Bead Kit（Miltenyi公司）；SA-β-gal Staining Kit（Cell Signaling公司）；L-谷氨酰胺、甲基纤维素（Sigma公司）；rhGM-CSF，rhEPO（麒麟鲲鹏生物药业有限公司）；PCR引物（Invitrogen公司）；sybr green I（Biorad公司）；荧光定量PCR试剂盒（TaKaRa公司）。

2 方法

2.1 雄鼠Sca-1+HSC/HPC分离纯化及鉴定 按本室方法用免疫磁性分选法分离Sca-1+细胞[4]。收集分选前标记的单个核细胞（MNC）及分选后Sca-1+细胞，流式细胞术检测分选细胞纯度，台盼蓝染色检测细胞的存活率。

2.2 雌性受体鼠造血衰竭模型制备及分组 雌性受体鼠20只置于面积为15 cm×15 cm特制有机玻璃照射盒中，给予60Co γ线全身一次性致死剂量（8.5 Gy）照射，照射距离75 cm，剂量率57.28 cGy·min-1。实验分组：①空白对照组：不做任何处理；②照射对照组：照射后4～6 h，经尾静脉输注无菌PBS 0.2 mL；③衰老模型组：照射后4～6 h，经尾静脉移植雄性供体鼠Sca-1+HSC/HPC悬液0.2 mL，含Sca-1+HSPC 2×104个；④Rg1治疗衰老组：照射后移植移植组等量Sca-1+HSC/HPC，移植后给予Rg1每只20 mg·kg-1·d-1，30 d；⑤Rg1延缓衰老组：照射前给予Rg1每只20 mg·kg-1·d-1，10 d，照射后处理同Rg1抗衰老组。移植后30 d从第1代受体鼠骨髓细胞中分离纯化供体Sca-1+HSC/HPC，用同样方法输注入第2代雌性受体鼠体内，连续移植3代，各实验组每代受体鼠分离纯化的Sca-1+HSC/HPC进行相关生物学检测。

2.3 受体鼠造血重建后骨髓细胞Y染色体（Sry基因）检测 提取受体鼠骨髓细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA的吸光度（A）A260/A280，1%凝胶电泳鉴定完整性。引物设计如下，Sry F：GAAAAGCCTTACAGAAGCCGA，R：GTATGTGATGGCATGTGGGTTC。将总RNA反转录为相应的cDNA，荧光定量PCR反应体系50 μL：2×PCR buffer 25 μL，25 μmol·L-1 Sry上游及下游引物各0.6 μL，cDNA 1 μL，Sybr green I 0.3 μL，DEPC水22.5 μL。反应条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环35次；72 ℃检测荧光信号。每个样本做3个平行管。

2.4 血常规检测及受体鼠生存时间观察 各组受体鼠移植后第30天，摘眼球取血，用血细胞分析仪检测血常规（WBC，HCT，PLT），观察移植后受体鼠的存活时间及30 d存活情况。

2.5 造血干细胞衰老相关生物学检测 SA-β-半乳糖苷酶染色：分离纯化各组受体鼠Sca-1+HSC/HPC，用PBS离心洗涤细胞2次，按照SA-β-Gal Staining Kit方法操作，在37 ℃，无CO2条件下孵育12 h染色细胞。孵育后离心甩片，使每张甩片的细胞数为1×104个，70%甘油封片镜检。每张甩片随机计数400个细胞，观察和计数阳性细胞的百分比。

造血祖细胞混合集落（CFU-Mix）培养：参照文献方法[5-6]改进，依次加入2-巯基乙醇（1×10-4 mol·L-1），3%L-谷氨酰胺，马血清，rhEPO，IL-3，rhGM-CSF，分别加入1×104个分离纯化的各组受体鼠Sca-1+HSC/HPC，2.7%甲基纤维素，总体积2 mL，充分混匀后接种于96孔板（0.2 mL/孔），在37 ℃，含5%CO2饱和湿度的培养箱中培养7 d，根据种植Sca-1+HSC/HPC数与形成CFU-Mix数评价各组细胞形成造血祖细胞集落能力与多向分化潜能。

流式细胞术细胞周期分析：分离纯化各组每代受体鼠Sca-1+HSC/HPC经70%冰乙醇固定过夜，100 μL牛胰核糖核酸酶37 ℃孵育30 min，碘化丙啶染色30 min，流式细胞术检测各组细胞的细胞周期时相。

2.6 统计学分析 运用SPSS软件进行实验数据统计学处理，采用析因设计、单因素方差分析方法，数据均以±s表示，P

3 结果

3.1 Sca-1+HSC/HPC分离纯化及鉴定 MACS分选前MNC中Sca-1+细胞百分比为（1.8±1.2）%；分离纯化后Sca-1+细胞纯度达（87.3±1.2）%；台盼蓝拒染检测分选前MNC细胞活性为99%～100%，分选后的Sca-1+HSC活性为97%～99%，提示分选的Sca-1+HSC有较高纯度和活性。

3.2 受体鼠造血重建后骨髓细胞Y染色体（Sry基因）检测 移植后第一、二、三代受体鼠骨髓细胞均有Sry基因表达，移植一代正常受体鼠与移植受体鼠Sry基因表达量为（1.74±0.03），（1.06±0.03），移植二代正常受体鼠与移植受体鼠Sry基因表达量为（1.67±0.03），（0.94±0.01），移植三代正常受体鼠与移植受体鼠Sry基因表达量为（0.65±0.02），（0.58±0.02），移植受体鼠与正常受体鼠鼠Sry基因表达差异无统计学意义；正常雌性小鼠骨髓细胞无Sry基因表达，移植一、二、三代正常雌性鼠Sry基因表达量分别为（0.008±0.000 6），（0.005±0.000 7），（0.003±0.000 7），其与正常受体小鼠及移植受体鼠Sry基因表达差异有统计学意义（P

3.3 受体鼠外周血变化 随移植代数的增加，每代移植受体鼠重建造血能力下降，外周血各时相WBC，HCT和PLT恢复延缓；每代Rg1治疗衰老组及Rg1延缓衰老组WBC，HCT和PLT高于同代衰老模型组；Rg1延缓衰老组高于同代Rg1治疗衰老组（表1）。表1 各组Sca-1+ HSC/HPC的外周血各时相变化（±s，n=6）

Table 1 Changs of peripheral blood to Sca-1+ HSC/HPC（±s，n=6）

注：与空白对照组相比1）P

3.4 受体鼠30 d存活率观察 对照组受体鼠移植后7～15 d全部死亡；移植后30 d，移植一代衰老模型组、治疗衰老组、延缓衰老组受体鼠存活率分别为（73.3±16.3）%，（83.3±15.1）%，（80.0±12.6）%，移植二代衰老模型组、治疗衰老组、延缓衰老组受体鼠存活率分别为（60.0±17.9）%，（70.0±10.9）%，（66.7±10.3）%，移植三代衰老模型组、治疗衰老组、延缓衰老组受体鼠存活率分别为（50.0±16.7）%，（56.7±15.1）%，（60.0±12.6）%。各组移植受体鼠存活时间均大于20 d，随移植代数增加，受体鼠存活时间缩短（P

3.5 Rg1对受体鼠Sca-1+ HSC/HPC SA-β-半乳糖苷酶染色阳性率的影响 SA-β-Gal染色阳性细胞胞浆内可见蓝色颗粒；阴性细胞不着色（图1）。随移植代数增加，每代移植受体鼠Sca-1+ HSC/HPC SA-β-Gal染色阳性率增加；各代Rg1治疗衰老组及延缓衰老组SA-β-Gal染色阳性率低于同代衰老模型组；Rg1延缓衰老组低于Rg1治疗衰老组（图2）。

3.6 Rg1对受体鼠Sca-1+ HSC/HPC CFU-Mix形成能力的影响 空白对照组小鼠Sca-1+HSC/HPC形成CFU-Mix个数为（34±3.14）个，移植一代衰老模型组、治疗组、延缓衰老组形成CFU-Mix个数分别为（10.23±3.11），（15.23±1.36），（17.15±4.14），移植二代衰老模型组、治疗组、延缓衰老组形成CFU-Mix个数分别为（7.07±2.06），（10.15±

图1 受体鼠Sca-1+ HSC/HPC SA-β-半乳糖苷酶染色（×400）

Fig.1 SA-β-gal staining to Sca-1+ HSC/HPC of receptor mice（×400）

图2 Rg1对受体鼠Sca-1+ HSC/HPC SA-β-半乳糖苷酶染色阳性率的影响

Fig.2 Effect of Rg1 on the percentage of SA-β-gal staining positive cells to Sca-1+ HSC/HPC of receptor mice

4.06），（13.08±2.93），移植三代衰老模型组、治疗组、延缓衰老组形成CFU-Mix个数分别为（2.31±1.38），（4.85±2.03），（6.15±2.27）。随移植代数的增加，每代移植受体鼠Sca-1+HSC/HPC形成CFU-Mix个数逐渐减少（P

3.7 Rg1对受体鼠Sca-1+ HSC/HPC细胞周期分布的影响 随移植代数的增加，各代移植受体鼠Sca-1+HSC/HPC G0/G1期比例明显增高，增殖指数PI（S+G2/M）明显降低；每代Rg1治疗衰老及延缓衰老组G0/G1期比例低于、PI高于同代衰老模型组；每代Rg1延缓衰老组各指标变化优于Rg1治疗衰老组（表2）。

表2 Rg1对受体鼠Sca-1+HSC HSC/HPC细胞周期分布的影响（±s，n=6）

Table 2 Effect of Rg1 on distribution of cell cycle to Sca-1+HSC/HPC of receptor mice（±s，n=6）%

4 讨论

干细胞衰老学说是迄今解释机体衰老机制的最新学说，造血干细胞衰老与机体衰老密切相关，研究表明，尽管在机体衰老过程中造血系统的基本成分得以维持，但造血干祖细胞的数量和潜能是逐渐降低的，即造血干细胞发生了衰老[7-8]。HSC/HPC衰老与机体衰老密切相关，HSC/HPC衰老将导致血细胞发生失去正常调控、机体免疫功能低下、肿瘤发生率增加，并与老年性白血病及再生障碍性贫血的发生密切相关[9-10]，可见探寻HSC/HPC衰老的生物学机制及寻找延缓HSC/HPC衰老的有效方法对延年益寿和防治老年性疾病有着重要理论和应用价值。

衰老模型的建立是研究衰老机制及探求调控衰老方法的前提，作者运用Sca-1+HSC/HPC体内连续移植实验构建Sca-1+HSC/HPC衰老体内模型。本实验将雄性Y染色体的Sry基因作为追踪移植细胞的植入及存活的标志，检测受体鼠骨髓细胞Sry均表达阳性，证明连续移植过程中受体鼠重建造血细胞均来源于雄性供体鼠。在Sca-1+HSC/HPC连续移植3代过程中，供体鼠Sca-1+HSC/HPC逐渐失去在受体鼠内重建造血能力，供体鼠衍生的HSC/HPC自我更新及多向分化潜能降低、外周血恢复延缓，最终导致受体鼠死亡，供体鼠衍生的HSC/HPC表现出干细胞衰老特征：SA-β-gal染色阳性率及G1期细胞比例增加，HSC/HPC自我更新和多向分化潜能下降，形成CFU-Mix能力及集落个数减少。

人参是祖国医学重要的“补气”要药，人参皂苷是人参的主要药效成分，研究证明：人参皂苷单体Rg1是人参抗衰老的活性成分，具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力等作用[11-13]。最近研究发现，人参皂苷Rg1能明显延长机体寿命及细胞寿命，能延长老年大鼠的存活时间，并可明显改善老年大鼠衰退的行为活动功能；在适当浓度Rg1的培养体系中，二倍体成纤维细胞有丝分裂活性和生长速度增加，并可增加晚代细胞的传代次数，延长细胞的寿命[14-15]。

Sca-1+ HSC/HPC连续移植3代过程中作者给予Rg1抗衰老及延缓衰老处理，结果显示： Rg1能明显提高移植受体鼠30 d的存活数量，并能增强连续移植过程中Sca-1+ HSC/HPC重建造血能力，每代Rg1治疗衰老组及Rg1延缓衰老组WBC，HCT和PLT恢复均优于同代衰老模型组。与衰老模型组相比，Rg1治疗衰老组及Rg1延缓衰老组Sca-1+ HSC/HPC由G0/G1期进入S期的数量增加，形成CFU-Mix能力增强，而SA-β-Gal染色阳性率降低，Rg1延缓衰老组各指标改变均较同代Rg1治疗衰老组明显，以上结果提示：Rg1能增强Sca-1+ HSC/HPC自我更新及多向分化潜能，Rg1治疗衰老组及Rg1延缓衰老组衰老的Sca-1+ HSC/HPC少于衰老模型组，Rg1在体内具有较好的抗Sca-1+ HSC/HPC衰老的作用，Rg1延缓Sca-1+ HSC/HPC衰老的作用优于Rg1抗Sca-1+ HSC/HPC衰老的作用。

作者既往的研究证实Rg1在体外能显著延缓三丁基过氧化氢诱导的Sca-1+ HSC/HPC的衰老[16]，结合本实验的研究结果，从体内外2条途径证实Rg1具有显著抗Sca-1+ HSC/HPC衰老的作用。在后续的研究中将进一步探讨Rg1在体内抗衰老潜能的生物学调控机制。

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Study on anti-aging effect of ginsenoside Rg1 in serial transplantation of

hematopoietic stem cells and progenitor cells

ZHOU Yue， WANG Jian-wei， JIANG Rong， YAO Xin， YANG Bing， CAI Shi-zhongLIU Jun， LIU Dian-feng， WANG Ya-ping（1. Engineering Research Room of Stem Cells and Tissues， Teaching and Research Room of Histology and

Embryology， Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China；

2. Teaching and Research Room of Histology and Embryology， Dali University， Yunnan 671000， China）

[Abstract] Objective： To investigate the anti-aging effect of ginsenoside R1 in serial transplantation of hematopoietic stem cells and progenitor cells. Method： HSC/HPC aging model in vivo was established through the Sca-1+HSC/HPC serial transplantation of male donor mice that had been separated and purified by the magnetic-activated cell sorting method. The female recipient mice that had been radiated with lethal dose of 60Co γ ray were divided into four groups： the control group， the aging group， the Rg1-treated aging group and the Rg1anti-aging group. The expression of Sry genes in bone marrow cells of recipient mice was analyzed by fluorescence quantitative PCR， in order to determine the source of hematopoietic reconstruction cells， observe the survival time and the recovery of the hematology of peripheral blood， and study the reconstruction of the hematopoietic function of recipient mice， the hematopoietic recovery promoted by Rg1， the culture of CFU-Mix of hemopoietic progenitor cells， the cell cycle analysis and aging-related SA-β-Gal staining analysis on biological characteristics of Sca-1+HSC/HPC aging， and the effect of Rg1 in vivo regulation on Sca-1+ HSC/HPC aging. Result： The hematopoietic reconstruction cells of female recipient mice were derived from male donor mice. With the serial transplantation， the 30-day survival rate and the hematology in peripheral blood of recipient mice decreased. Sca-1+ HSC/HPC showed aging characteristics： the ratio of cells in G0/G1 phase and the positive rate of SA-β-gal staining increased， whereas the number of CFU-Mix decreased. Compared with the aging group of the same generation， Rg1-treated aging group and Rg1 anti-aging group showed higher 30-day survival rate and WBC， HCT， PLT and CFU-Mix， and lower cell ratio in Sca-1+HSC/HPC G0/G1stage and positive rate of SA-β-gal staining. The Rg1 anti-aging group showed more significant changes than the Rg1-treated aging group. Conclusion： Ginsenoside Rg1 has the effect of delaying and treating Sca-1+ HSC/HPC aging during the serial transplantation. Rg1′s anti-aging effect is superior to its effect of treating aging.

[Key words] ginsenoside Rg1； HSC/HPC； anti-aging； serial transplantation

doi：10.4268/cjcmm20131720