毒死蜱致雄性生殖毒性及其机制的研究进展

[摘要] 毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）系有机磷农药（organophosphates，OPs），广泛应用于农业生产和居住环境。毒死蜱不仅具有急性毒性，其慢性毒性和潜在危害日益引起业界关注。有研究提示CPF为可疑的环境内分泌干扰物（EEDs），具有生殖发育毒性。CPF的雄性生殖毒性主要表现为组织病理学、质量、激素水平和标志酶活性等发生变化，提示可能机制以脂质过氧化损伤机制研究居多。本文就CPF的雄性生殖毒性及其可能机制进行综述。

[关键词] 毒死蜱；雄性；生殖毒性；机制；有机磷农药

[中图分类号] R994.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）02（a）-0020-04

毒死蜱（CPF）即 O，O-二乙基-O-（3，5，6-三氯-2-吡啶基）硫代磷酸酯，属广谱、低毒、高效OPs杀虫剂，不仅可以抑制生物体内胆碱酯酶的活性，还可以阻断植物的光合作用，是目前全世界生产和销售量最大的杀虫剂之一。2008年CPF在全球的销量大约为14万吨[1]，估计至2015年CPF全球市场需求量将达25.8万吨左右[2]；2012年初CPF约占我国农药销售总量的36%（2 312.47吨/6 328.72吨）。此外，CPF及其代谢物能够在空气、水、土壤和多种食物中长期残留[3-6]，已对环境和人类健康构成潜在危害。据内蒙古自治区统计，2003～2010年，自治区所产蔬菜的OPs持续高水平超标，其中CPF历年均有超标，并呈现上升的趋势[7]。

以往国内外广泛关注CPF的神经发育毒性，近年来越来越多的研究提示CPF可能具有环境内分泌干扰物（environmental endocrine disruptors，EEDs）样作用，而其生殖毒性和潜在危害正逐渐引起人们的重视。本文就近年来国内外有关CPF致雄性生殖毒性的研究资料，着重CPF诱导生殖器官的病理变化，对质量、激素水平和标志酶活性的影响，尤为对DNA的直接损伤及可能机制的进展综述，力图为CPF致雄性生殖毒性及其机制的研究提供一定的借鉴。

1 CPF对雄性生殖器官的影响及机制

1.1 CPF致和附睾的退行性变化

雄性生殖器官是物种延续和进化的必要保障。雄性生殖器官的退变将带来物种的衰败，甚至绝迹。（1）CPF可致雄性有脊动物及附睾重量和体积的退行性改变。Faraga AT等[8]的研究提示，大鼠经灌胃染毒25 mg/（kg·d）的CPF，引起重量明显下降。Joshi SC等[9]和Afaf A等[10]的研究也得出相似的结果。然而，刘相鑫[11]以2.7、5.4、12.8 mg/kg剂量CPF对雄性大鼠连续染毒90 d，结果、附睾重量和脏器系数的变化差异均无统计学意义；而文一等[12]以7.35 mg/kg剂量CPF灌胃染毒8周后，雄性大鼠的和附睾重量及脏器系数较对照组却均有显著增加。（2）CPF致和附睾发生退行性变化的主要病理学改变表现为：CPF可引起生精小管和曲细精管萎缩，生精上皮排列紊乱、管腔内有脱落的和细胞、间质变宽、各级生精细胞减少及成熟数量明显下降等[13-15]。（3）CPF可能引起雄性生殖器畸形[16]。美国个案曾报道，4名儿童因其母在妊娠前3个月接触CPF，出现广泛的出生缺陷，包括脑、眼、耳、腭、牙、心、足、和生殖器等缺陷[17]。这方面的研究由于缺少人群资料，目前仍存在争议，有待于进一步调查研究。

1.2 CPF致和附睾发生退行性变化的影响因素和可能机制

实验研究中有脊动物、附睾重量和体积的改变，与CPF染毒途径、剂量、采样时间等因素有关。但在体重未变的情况下重量减轻，提示可能是内生殖细胞减少所致，而非营养因素造成的[18]。有大量研究表明CPF可引起生精小管发生退行性变，导致发生停止、数量下降。而生精小管水肿、间质细胞间质空隙增宽、附睾管发生充血和水肿的原因，可能是由于CPF穿过血睾屏障，诱发氧化应激和脂质过氧化从而损害生物膜，进而损害间质细胞，使间质空隙扩大；生发细胞脱落进入管腔使间质空隙增宽，且随着的流失附睾管间质空隙也会有所增加[13]。此外，重量的下降还可能与间质细胞类固醇的生物合成有关。而和附睾重量及脏器系数的增加可能是由于充血、水肿或增生肥大所致，其次，随着CPF染毒剂量的增加，实验对象体重增长速度缓慢也为可能因素之一。

CPF致组织病理学改变的主要机制与氧化应激和脂质过氧化作用有关。脂质过氧化作用是大多数组织细胞损伤的共同通路之一，一些研究提示CPF可引起参与脂质过氧化过程的相关酶及脂质过氧化反应的主要代谢产物丙二醛（malondialdehyde，MDA）发生改变[19-20]。此外，还有研究认为低剂量暴露时，CPF能通过脂质过氧化作用破坏组织细胞结构和功能的完整性，从而对机体造成损伤；而高剂量时会激活大鼠的天然防御机制，通过改变抗氧化防御酶系（超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶）和类固醇合成酶（3β-羟基类固醇脱氢酶和17β-羟类固醇脱氢酶）的活性及垂体促性腺激素的反馈机制而致组织细胞发生病理学改变[19-21]。

2 CPF对标志酶和生殖内分泌的影响及其机制

2.1 CPF对标志酶的影响及其机制

雄性生殖器官的发育、成熟以及的发生、分化均需要充足的能量供给。在能量供给过程中，许多酶系发挥着重要作用。各种标志酶的量和活性的改变，必将影响雄性生殖器官的发育与成熟。

2.1.1 CPF对标志酶的影响 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）为生精上皮的成熟和各级生精细胞的发育提供能量，若LDH活力受到抑制，将会阻碍生精细胞能量的供给，并导致精原细胞等变性凋亡[22]；LDH-x是LDH的同工酶，为发生提供能量并维持的活力[23]。山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase，SDH）为的发育提供能量，成熟期重量与SDH的活力出现同步增加趋势，是成熟的标志性物质[24]。酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）主要位于支持细胞和的溶酶体内，清除受损或衰老细胞，保持正常代谢和生理功能，可作为衡量是否有生精障碍的指标[15]。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）参与细胞增殖、分裂与分化时的营养物质运输。β-谷氨酰转移酶（β-GT）是支持细胞的特异标志酶，它的活性与支持细胞的功能息息相关。

CPF对各种标志酶活力影响的研究结果不尽一致。研究显示，大鼠CPF暴露后，LDH和LDH-x的活力升高，而SDH和ACP的活力未见显著影响[11]；但是焦利飞等[25]研究却显示，CPF暴露导致AKP和β-GT的活力下降以及LDH的下降；文一等[12]研究可见CPF暴露致ACP、LDH和AKP的活力下降，基本同于焦利飞；但是β-GT的活力则出现升高趋势。Afaf A等[10]研究中，LDH、ACP和AKP的活力也明显下降。然而，Akhtar N等[13]研究却提示，CPF对标志酶LDH和ALP的活力均没有影响。导致上述研究结果的不一致性，可能与实验动物品系、染毒时间及染毒剂量的不同等因素有关，其具体机制还有待进一步研究。

2.1.2 CPF对标志酶的影响的可能机制 刘相鑫[11]力图通过检测LDH和ACP相关基因的表达水平，揭示CPF暴露对标志酶的影响机制，结果显示其基因表达水平与CPF暴露后标志酶的变化没有显著差异，提示CPF并不是通过诱导标志酶基因表达水平而导致LDH和LDH-x的活力升高；而CPF暴露后机体代偿性应激反应可能是LDH和LDH-x的活力升高的原因之一。实验动物品系、染毒时间及染毒剂量的不同等因素可能与众家研究结果的差异有关，而CPF对标志酶的影响的机制尚不充分，有待进一步研究。

2.2 CPF对生殖内分泌的影响及其机制

许多有机磷农药已明确具有类雌激素样作用，但CPF是否具有内分泌干扰作用，目前国际上仍有争议。Gunda Viswanath等[26]研究发现，CPF能干扰雄激素的合成；此外，Andersen HR等[27]研究表明CPF存在部分雌激素样作用。然而也有一些研究得出不一致的结论[28-29]。

2.2.1 CPF对生殖内分泌的影响 随着研究的深入，近年来有关于CPF对雄性内分泌影响的报道，主要是雄激素睾酮（testosterone，T）、黄体生成素（luteinizing hormone，LH）和促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，FSH）。有研究表明，CPF能使血清中T水平降低[9，11]。但是对FSH和LH水平的影响结果不尽一致。刘相鑫[11]研究发现，随着CPF染毒剂量的增加，Wistar雄性大鼠血清中FSH含量逐渐升高，且中、高剂量组与对照组相比差异有统计学意义（P < 0.05）；而中、高剂量组血清中LH高于对照组，但差异无统计学意义（P > 0.05）。此外，焦利飞等[25]对3～4周龄Wistar雄性大鼠经灌胃染毒0、1、5、10 mg/kg的CPF，结果显示大鼠LH含量随染毒剂量增加呈降低的趋势，但各剂量组与对照组相比差异无统计学意义；并且随剂量的增加，FSH各剂量组与对照组相比，均未出现显著性差异。

2.2.2 CPF对生殖内分泌影响的可能机制 正常生理情况下，睾酮（T）的合成主要受下丘脑-垂体-轴（hypothalamic-pituitary-testicular axis，HPTA）的调节控制。而血清T水平的下降可能机制之一是间质细胞受损，因为间质细胞是合成和分泌睾酮的主要部位；其次可能是类固醇生成急性调控蛋白（StAR）活性受到抑制。T主要由间质细胞内的胆固醇经过一系列反应转化而成，在一系列反应过程中，首先胆固醇需经主动转运从膜外进入膜内，而转运受控于StAR的调节。有机磷农药可引起细胞膜氧化损伤，增加脂质过氧化物含量，激活环氧合酶-2的活性，抑制了StAR转录和翻译，进一步减少甾类激素的合成继而降低T的水平[30]。此外，还有研究认为，CPF可抑制大鼠间质细胞内甾体发生过程中的关键酶如：P450、3β和17-β羟化酶，使胆固醇向T转化受阻[26]。而FSH和LH的变化可能是由于T、FSH和LH之间的负反馈调节引起的[31]。

由于内分泌的调节机制比较复杂，并且T、FSH和LH之间存在复杂的负反馈调节机制，其中任一环节受到影响都会影响激素水平。所以，要想阐明CPF对激素的影响还有需进行更深入的研究。

3 CPF对的影响及其机制

雄性生殖系统的主要功能是产生，使之成功地与卵子结合，这就要求具有足够的数量、适当的运动能力和受精能力。一般说来，比其他细胞更易受到毒物的损伤[9]，因此，质量是评估雄性生育功能最常用的指标，可反映早期的生殖损害。

3.1 CPF对的影响

CPF可引起大鼠数目减少，活动度下降，畸形率增加等生精功能障碍。文一等[12]以0、0.82、2.45和7.35 mg/（kg·d）剂量的CPF对6周龄雄性SD大鼠灌胃染毒8周，结果显示高剂量组的数量、活动率显著低于对照组，而畸形率高于对照组。Joshi SC等[9]也得到类似的结果。而Akhtar N等[13]以3、6、9 mg/kg剂量对大鼠染毒90 d，结果9 mg/kg剂量组数量明显低于对照组，而形态和活力却没有显著变化。

而CPF对影响的人群资料并不是很多。Meeker JD等[32]报道指出，CPF代谢物3，5，6-三氯-2-吡啶酚（3，5，6-trichloropyridine-2-phenol，TCP）会引起成人男性体内的质量下降，并且使激素水平下降。

3.2 CPF对影响的可能机制

CPF损伤的可能机制如下：（1）CPF通过血睾屏障而直接作用于生精细胞，从而干扰的生长、发育和能量代谢过程，导致数量下降，并且CPF能引起部分发生的停止而使数减少[8]。（2）可能与CPF诱发生殖细胞凋亡有关。焦利飞等[25]采用TUNEL法检测显示，随CPF染毒剂量增加生精细胞凋亡明显增加；作者进一步检测发现引起生精细胞凋亡的可能机制是CPF使睾九生殖细胞中Caspase3表达明显增加而导致细胞凋亡，另外CPF还可能通过增加Fas及FasL蛋白的表达，从而促进生精细胞凋亡，可能也是其抑制发生、减少活动度的机制之一。（3）正常的数量和质量有赖于生精过程中各种酶的维持，因此，各种酶的活性可能与生精过程受损、动力学改变存在一定的关联。（4）正常的产生、分化和成熟也受HPTA的调节。但是否因为HPTA内分泌功能的改变干扰了发生过程，单一的血清激素水平变化并不能完全解释，还需要从细胞和分子水平进一步探索CPF对性腺轴系统的毒理学作用机制。（6）CPF对大鼠的致畸作用可能是通过损伤DNA引起的，这还有待进一步的研究。

4 CPF对DNA的影响及其机制

4.1 CPF对DNA的影响

有研究报道，有机磷农药可能会通过脂质过氧化作用而使DNA发生交联[33]，也可能会诱发细胞核鱼精蛋白磷酸化水平增加，形成的二硫键减少，而影响染色质结构的稳定性[34]。推测CPF对DNA有类似的作用。曹锐[35]却发现0.01、0.1、1.0、10.0 mg/kg 4个剂量的CPF对蚯蚓体腔细胞DNA均有损伤作用，并且DNA损伤程度随CPF剂量的增加而增大。但CPF对细菌和中国仓鼠的致突变性研究显示其既不引起染色体损伤也不引起DNA损伤[36]。

Meeker JD等[37]利用彗星实验测定CPF对人的DNA的损伤情况，结果表明CPF处理的DNA有明显的拖尾现象，因此认为CPF对人的DNA有损伤。Elsa Salazar-Arrdond等[38]也发现CPF及其氧化代谢物能对人类的DNA造成损伤[38]。

4.2 CPF对DNA影响的可能机制

目前关于CPF造成DNA损伤机制的研究报道较少，有研究表明CPF进入生物体后有可能通过形成DNA加合物的形式而造成DNA损伤[39]；Rahman MF等[40]发现，CPF可作为一种烷化剂，能使DNA碱基发生烷基化反应，当谷胱甘肽含量低于某一水平或耗尽时就会导致DNA链断裂。此外，赵长瑶等[41]研究表明，CPF还可能通过一定途径影响大鼠生殖细胞中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，PCNA基因表达是细胞DNA复制、细胞增殖的一个标志，但其具体分子机制还有待进一步研究。

5 CPF对雄性生育力的影响及其机制

5.1 CPF对雄性生育力的影响

有研究表明，雄性大鼠染毒有机磷农药后与雌鼠，会引起宫内发育迟缓、胎儿畸形及着床数、活胎数、雄雌性别比例、雄性指数、生育指数和子代存活率降低[31，42]。也有关于CPF对雄性生育力影响的报道，Amina T等[8]给10周龄雄性CD-1小鼠灌胃染毒0、7.5、12.5和17.5 mg/（kg·d）剂量的CPF4周后，使其与雌鼠进行，结果显示中、高剂量组雄鼠系数和生殖参数明显下降，并且高剂量组活胎数有所下降而吸收胎和死胎增多。此外，Joshi SC等[9]以0、7.5、12.5和17.5 mg/kg剂量的CPF对Wistar大鼠灌胃染毒30 d，在染毒第25～30 d进行生育力测试，结果显示低、中、高CPF剂量组生育实验结果阴性分别为30%、80%和85%。

5.2 CPF对雄性生育力影响的可能机制

Faraga AT等[8]分析在中高剂量组系数受到影响，主要原因可能是由于CPF引起睾酮水平下降而影响引起的；另外，繁殖系数的下降可能仅代表CPF对系数和组织学的改变，而的发生和繁殖力主要依赖睾酮来维持；然而，只有暴露于CPF高剂量组的雄鼠妊娠结局受到影响，因而CPF介导雄性对妊娠结局的作用不能直接归因于CPF的毒性。

尽管实验研究表明CPF对雄性生育力有影响，但由于其也可干扰生殖内分泌，因此对人类是否有类似的作用还需要进一步证实。

6 结语

综上所述，有机磷农药CPF能够损伤雄性生殖系统，但针对雄性生殖功能某些重要指标的研究并未得出一致的结论，并且对雄性生殖系统的损伤机制也有待进一步研究。此外，目前CPF的雄性生殖毒理学研究主要限于动物实验，人群研究较少。由于种属间及农药在体内生物转化的差异，致使动物实验结果外推到人会有较大误差，所以应在进一步动物实验研究的基础上开展人群研究。然而人群研究的干扰因素较多，广泛接触各种类型的环境因素而使人类生殖功能可能受到多方面有害因素的影响，并且人类可能同时会接触多种农药，因此人群研究的难度也较大。

鉴于CPF在我国生产使用量大，在环境和食品中残留严重，具有潜在的生殖毒性等远期危害。并且在对CPF较敏感的围生期低剂量长期暴露后，是否会对成年雄性生殖系统产生影响还有待证实。因此，为进一步阐明CPF对雄性生殖系统的毒作用及机制，筛选早期生物标志物，减轻和逆转有机磷农药CPF对机体的损害及对生殖结局的影响，提高出生人口素质，有必要全面、系统、深入地开展CPF对雄性生殖系统作用的研究。

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（收稿日期：2012-12-17 本文编辑：陈 俊）